Способ определения иммунореактивности животных

.Коропо ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарнойиммунологии и биохимии, в частности к разработке способа определения иммунореакИзобретение от иммунологии и биох работке способа о активности организ Цель изобрете вительтности спосо Для этого испо ала суспенэию ле крови, определяют низованные ЯН-гр путем добавления клеток в качестве конечной концентр рэ, с последующей падения силы тока личеству высвобо ющих ЯН-групп,проводят по сумменосится к ветеринарнои имии, в частности, к разпаределения иммунорема,ния - повышение чувстба.льзуя в качества материикоцитов и лимфоцитов вяло реагирующими, экрауппы на их поверхностик титруемой суспенэии детергента мочевины в эции до 1;5-2,0 И растворегистрацией величины , пропорциональной кождающихся вяло реагируа учет результатов легко и вяло реагируютивности организма, Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Для этого в качества испытуемого материала используют суспензию лейкоцитов и лимфоцитов крови, на поверхности которых проводят определение свободных легко реагирующих сульфгидрильных групп и дополнительно вяло реагирующих экранированных ЯН-групп путем добавления к титруемой суспензии клеток мочевины в концентрации до 1,5 - 2,0 н, раствора, с последующей регистрацией величины падения силы тока. При этом у животных с высокой иммунореактивностью содержание ЯН-групп составляет 19,80,5 10 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитными состояними - 10 10 15 - 2,5 10 моль/клетка, 5 табл. щих ЯН-групп моль/клетка, при этом у здовых животных с высокой иммунореактивностью содержание всех 5 Н-групп составляет 19,8 + 0,5 10 моль/клетка, а у животных с иммунодефицитнымисостояниями 10 10- 2,5 10 моль/клетка.-15П р и м е р 1. В пробирку, содержащую раствор ЭДТА отбирают кровь из вены животного, затем к 1,0 мл крови доСавляют дистилированную воду (или гемолитическуо смесь с сапонином) в отношении 1:20, перемешивают в течение 15 с и немедленно прибавляют 10-кратный раствор Хенкса для восстановления осмотического давления. Клетки осаждают центрифугированием при 400 9 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают и вновь прибавляют сначала дистидированную воду, а затем спустя 15 с5 10 15 раствор Хенкса и повторно осаждают центрифугированием. К осадку добавляют 15 мл аммиачно-нитратного 0,1 й буфера с рН 6,8. Лимфоциты иэ крови выделяют методом дифференциального центрифугирования в 17;-ном растворе верографина,Полученные суспензии клеток помещают в стаканчик объемом 30 мл и добавляют аммиачно-нитратный буфер (рН 6,8, 0,1 й) до обьема 25 мл, В раствор погружают электроды и определяют величину исходного тока по гальванометру. Титрацию ведут раствором 0,5 10 М нитрата серебра по 50 мкл (0,05 мл). Способ определения ЯН- групп на поверхности клеток основан на том, что порции азотно-кислого серебра, реагирующие со свободными легко доступными ЯН-группами, связываются не вызывая при этом появления тока, Однако, как только все доступные ЯН-группы будут блокированы, в растворе появляются свободные ионы серебра, которые восстанавливаются на платиновом электроде, что вызывает появление диффузионного тока. Сила тока пропорциональна концентрации ионов металла в растворе, Откладывая на графике силу тока против количества добавленного реагента, определяют конечную точку титрования (точку эквивалентности), Количество пошедшего раствора серебра в молях делят на число клеток в суспензии, определяя тем самым среднее содержание свободных легко реагирующих ЯН-групп на одну клетку, моль/клетка. Определение числа клеток проводят либо на целоскопе, либо в камере Горяева.Затем для определения числа вяло реагирующих свободных ЯН-групп на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов к титруемой пробе добавляют мочевину до конечной концентрации ее 2 й, при этом происходит разрыхление структур мембранных белков и высвобождение ранее экранированных малодоступных ЯН-групп, которые быстро связываются с избытком ионов серебра, находящихся в растворе, в результате чего сила тока падает пропорционально.количеству высвобождающихся вяло реагирующих ЯН-групп. По величине снижения тока рассчитывают количество азотно-кислого серебра в молях, Эту величину делят на число клеток, определяя содержание ЯН-групп в молях на одну клетку. Общее количество всех свободных ЯН- групп в мембране равно сумме легко и вяло реагирующих ЯН-групп.Так на титрацию суспензии лейкоцитов кролика, сорержащую 7 10 клеток, идет 0,12 5 10 моль А 9 МОз. Количество легко реагирующих ЯН-групп, р, - 10,12 ,)10 0 08, 10-13 8, 10-157 10моль/клетка,При добавлении к титруемой смеси 3 г сухой мочевины (2 Й раствор) происходит в течение 5 мин снижение силы тока на 3 мА по гальвонометру. Такое снижение обуславливает связывание 0,15 0,5 10 раствора азотно-кислого серебра, Содержание0,15 5,0 10вяло реагирующих ЯН-групп7 10 = 10,0 10моль/клетка.Общее содержание всех свободных ЯН- групп на поверхности клеток равно сумме легко и вяло реагирующих ЯН-групп.8 10 + 10 10 = 18 10 моль/клетка. Способ апробируют с положительнымрезультатом на животных инфицированныхвирусом лейкоза крупного рогатого скота(ВЛКРС) результаты которых приведены втаблицах,Из табл.1 видно, что у неинфицированных(здоровых) кроликов на поверхности одного лейкоцита содержится значительноеколичество свободных ЯН-групп (19,8 ++ 0 10моль/клетка), из которых 9,810моль/клетка приходится на легко реагирующие и 10,7 10 на вяло реагирую щие ЯН-группыУ животных инфицированных ВЛ КРСотмечается резкое снижение ЯН-групп наповерхности лейкоцитов в 2 - 3 раза, Этоснижение происходит как за счет легко реагирующих, так и вяло реагирующих ЯНгрупп, У 82 от числа инфицированных ВЛКРС кроликов содержание легко реагирующих ЯН-групп снижается в 2 - 8 раэ в сравнении с неинфицированными. У 43 ф содержание вяло реагирующих ЯН-группснижается в 2,5 - 10 раз и только у 8,6 количество вяло реагирующих ЯН-групп наблюдается в пределах нормы. Такимобразом определение легко и вяло реагирующих ЯН-групп свидетельствует о резкомснижении экспрессии ЯН-групп в мембранных белках на поверхности лейкоцитов илимфоцитов у животных инфицированныхВЛ КРС,Исследования показывают (табл.2), чтоу одного и того же здорового кролика напротяжении около месячного наблюдениясодержание легко и всех свободных ЯНгрупп является величиной стабильной и колеблется по отношению. к средней на10 - 12. Менее стабильным является содержание:вяло реагирующих ЯН-групп, количе 1631428ство их колеблется по отношению к средней на 32 , У инфицированных ВЛ КРС кроликов на всем протяжении наблюдения содержание ЯН-групп на поверхности лейкоцитов резко снижается, носит стабильный харак тер, Колебания уровня как легко реагирующих, так и всех ЯН-групп вокруг средней составляет 40 - 53 , а вяло реагирующих Я Н-групп - 75. Эти исследования свидетельствуют о том, что у животных, инфици рованных ВЛ КРС происходят глубокие и стойкие изменения мембран лейкоцитов, что ведет к снижению силы иммунного ответа на тимусзависимые и тимуснезависимые антигены. 15Из табл,З видно, что у инфицированных ВЛ КРС кроликов отмечается выраженное снижение легко реагирующих ЯН-групп в иммуноглобулинах класса 6 в 2,5 раза и одновременно снижение титров нормаль ных антител 6 класса в б раз. Между снижением ЯН-групп в иммуноглобулинах, уменьшением 5 Н-групп на поверхности лейкоцитов и снижением титров нормальных антител отмечается сильная кореляци онная связь. На основании изменения как лейкоцитов и лимфоцитов, так и иммуноглобулинов видно, что при инфицировании ВЛ КРС снижение иммунореактивности обусловлено как снижением клеточного,-так и 30 гуморального иммунитета.В табл,4 приведены данные, свидетельствующие, что в ответ на введение экзогенных липидных перекисей, полученных из льняного масла, в организме кроликов происходит 35 резкое усиление интенсивности свободно- радикальных процессов в липидах с резким повышением в крови и тканях продуктов перекисного окисления липидов. При этом, как видно из табл.4 происходят существен ные изменения содержания легко и вяло реагирующих ЯН-групп как на поверхности лейкоцитов и лимфоцитов, так и в иммуноглобулинах класса О. Оказывается, что наиболее уязвивым по отношению продуктов 45 перекисного окисления липидов является гуморальный иммунитет. Об этом саидетельствуют снижение ЯН-групп в иммуноглобулинах уже через 24 ч, падение титров нормальных антител через 48 ч, тогда как изменения со стороны ЯН-групп на поверхности лейкоцитов наступают намного позже (8 сут), Усиление процессов ПОЛ в организме таким образом ведет к резкому снижению иммунореактивности. С помощью определения ЯН-групп в иммуноглобулинах и на поверхности лейкоцитов можно выявить степень поражения при этом клеточного и гуморального иммунитета.В табл,5 представлены данные по динамике содержания ЯН-групп на поверхности лейкоцитов у кроликов инфицированных ВЛ КРС с выраженными явлениями иммунодефицита после введения в качестве иммунокорректора вакцины из коринебактерий КГб,Из табл,5 видно, что уже через сутки после введения вакцины резко возрастает содержание ЯН-групп на поверхности лейкоцитов в 2,5-3 раза (на 3 сут в 4 раза), У животных неинфицированных с нормальной иммунореактивностью увеличения ЯН- групп на поверхности лейкоцитов практически не отмечается.Формула изобретения Способ определения иммунореактивности животных, включающий определение легко реагирующих ЯН-групп в суспензии клеток путем проведения амперометрического титрования раствором азотнокислого серебра, последующим учетом результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, из клеток используют лейкоциты и лимфоциты, дополнительно проводят определение вяло реагирующих экранированных ЗН-групп путем добавления к суспензии клеток мочевины до конечной концентрации 1,5 - 2,0 М, учет результатов проводят по сумме легко и вяло реагирующих ЯН-грпп, при этом при значении 19,8 + 0,5 10моль/клетка животных считают с высокой иммунореактивностью, а при 2,5+ 10,0 10 моль/клетка - с иммунодефицитным состоянием.1631428 Таблица 1 Содержание свободных сульфгидрильных групп на поверхности лейкоцитов у здоровых и инфицированных ВЛ КРС кроликов, моль/клеткаСвобо ные В Ф и/п етка х 10 Легко реагирующие Вяло еаги ие С ммэ, все ЯН-г ппы 3 о овые 19,8 + 1,01 14,029,0 7 б168 Ин ици ованные ВЛ КРС 60 +6 10 15 1,2511,510 1631428 Таблица 2 Динамика содержания легко и вяло реагирующих ЯН-групп на поверхности лейкоцитов у одного и того же животного нэ протяжении 3-месячного наблюдения у здоровых и инфицированных ВЛ КРС кроликовТаблица 3 Взаимосвязь между содержанием ЯН-групп на поверхности лейкоцитов, количеством ЗН-групп в иммуноглобулинах класса 0 и титрами нормальных антител в сыворотке крови у неинфицированных и инфицированныхВЛ КРС кроликов Неин ици ованные Инфицированные Показатели Таблица 4 Динамика содержания ЯН-групп на поверхности лейкоцитов, в иммуноглобулинах класса О и титров нормальных антител у здоровыхкроликов после введения им в/м продуктов перекисного окисления льняного масла Свободно легко реагирующие ЯН-группы налейкоцитах, моль/клеткаСвободные легко реагирующие ЯН-группы виммуноглобулинах 6 класса, моль/мольВяло реагирующие ЯН-группы в иммуноглобулинах 6 класса моль/мольСумма всех ЯН-групп в иммуноглобулинах 6класса 97905 10 п =20 0,825+ 0,0312 1631428 Продолжение табл. 4 Вяло реагир, ЯН- группы на лейкоцитах Легко реагир, ЯН- группы в иммуноглобулинах 6 моль/моль Все свободные ЯН- группы, на лейкоцитах,моль/клетка Легко реагир. ЯН-группы на лейкоцитахВяло реагир, ЯН-группы на лейкоцитах Легко реагир. ЯН-группы в иммуноглобунах С, моль/моль Титры антител Титры нормальных антител В РАГА Все свободные ЯН-группы на лейкоцитах, моль/клеткаЛегко реагирующие ЯН-группы на лейкоцитах Вяло реагир. ЯН-группы на лейкоцитахЛегко реагир. ЯН-группы на иммуноглобулинах класса О моль/моль 10,3 3,3 10,3 11,0 21,2 27,6 0,69 0,96 0,54 0,79 0,54 0,28 14,0 20,5 20,5 16,9 22,0 18,5 88 8,0 12,9 88 10,5 12,1 5,3 6,0 88 9,6 5,9 10,0 4,8 16,0 13,2 0,43 0,58 0,49 0,72 0,43 0,36 1:64 1:64 1:32 88 1:16 1.4 1,16 29 63 15,7 20 20 5,8 19,3 16,1 63 10,9 13,8 12,7 9,6 3,0 12,9 10,3 9,07 14,5 63 0,60 0,64 0,42 0,38 0,27 0,29 Таблица 5 Динамика содержания свободных легко и вяло реагирующих ЯН-группна поверхности лейкоцитов и лимфоцитов кроликов инфицированных ВЛ КРС после однократного введения 2 млрд. взвеси убитых коринебактерий (приведена аналогичная динамика у здоровыхкроликов)