Способ получения белка, понижающего содержание холестерина в крови млекопитающих животных

СОНИ СОВЕТСНИХвввввввввввмФ 2 Р 21/00,21/ОО/1 ф 46) 1)4 АРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИИ 13,ВН" Р ПАТЕНТ к биотехзованоающего свойолестерина тных кроОПИСАНИЕ И.(71) Кабусики Кайся Эдванс(54) СПОСОБ- ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКАЩЕГО СОДЕРЖАНИЕ ХОЛЕСТЕРИНАИЛЕКОПИТАМЩИХ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относитсянологии и может быть испольдля получения белка, обладством понижать содержание хв крови млекопитающих живо биологическим путем. Для осуществления способа используют один из семиштаммов рода Яйгерососсцв, которыевыделены от здорового человека. Одиниэ щтаммов (РЕВМ ВР- ВР) .культивируют в питательной среде в Каихацу аэробныхусловиях при перемещивании.Полученную биомассу отделяют, дезинЯзава (7 Р) тегрируют, лизируют путем последовательного воздействия температурой ипротеолитическим ферментом. Иэ лизатаПОНИЖАЮ" выделяют осадок, обрабатывают его В КРОВИ РИК-азой и очищают диализом. Выходбелка СВР при использовании щтаммавйгерйососсив Гаесыш РЕВИ ВР 197,3 мг, он содержит 17 амино-кислот. Ыр более 802 мг/кг массы привнутрибрюшинном введении мыпам.2 табл.Изобретение относится к биотехнологии и касается получения гипохолестеринемически активного белка (СКР).Для осуществления способа используют один из семи штаммов, выделенныхиэ экскрементов здорового человека.Зарегистрированы в Научно-исследовательском институте Ферментации (РК 1)и переданы на хранение под номерамиГЕКИ-ВР: БТгерососсцв Гаесыш АЭЧ1009 РЕКИ ВРб, Бгерососсцв Еаеса 11 в АЭЧ 9001 РЕКИ ВР, БггерСососсцв ач 1 цш АЭЧ 2003 РЕКИ ВР,БСгерСососсцв ва 1 ча 1 цв АЭЧ 10001РЕКИ ВР, Бйгерйососсцв дцгапвАЭЧ 3001 ГЕКИ ВР-ЗОО, Бггерйососсцвпп.св АЭЧ 7001 РЕКИ ВР, Бгергососсцв ерхпцв АЭЧ 8001 РЕКИ ВР.Культурально-морфологические иФизиолого-биохимические свойства штаммов представлены в табл,Способ осуществляют следующим образом. 0,2 50 Выращивание одного из указанных микроорганизмов осуществляют известным методом. Например, биомасса может быть получена путем стационарного культивирования в питательном бу ЗО льоне в анаэробных условиях и может быть собрана путем центрифугирования культуры бактерий.Состав питательного бульона, г:Триптиказа 10Дрожжевойэкстракт 5Триптоза 3К,НРО 3КйРО, 340Триаммоний"- цитрат 2Твин 80 1Глюкоза 20Хлоргидрат45цистеинаСолевойраствор 5 млДистиллированная вода До 1 лрН 7, стерилизация с нагревом при 121 С в течение 15 мин.Солевой раствор содержит, г:ИяБОА 7 НО 11,5РеБО 7 Н О 0,68МпО 2 НО 2,4Дистиллированная вода 10 млПриготовление белка СКР,Выделение микроорганизмов, Каждый иэ указанныхмикробных штаммовинокулируют в питательный бульон Ковова,инкубируют без перемешивания при 37 С в течение 5-10 ч в аэробных условиях, подавая питательный бульон с определенной концентрацией жизнеспособных бактериальных клеток. Этот питательный бульон непрерывно центрифугируют со скоростью вращения центрифуги 12000 об/мин. Собранные бактериальные клетки затем промывают в солевом растворе (0,857 МаС 1) до трех раз.Дезинтеграция бактериальных клеток. Промытые клетки суспензируют в Физиологическом солевом растворе и теромически обрабатывают при 115 С в течение 10 мин, Промытые и суспензированные в Физиологическом солевом растворе бактериальные клетки дезинтегрируют ультразвуком.Удаление жира иэ клеток. Дезинтего рированную клеточную суспензию смешивают со смесью. хлороформ - метанол (2;1 об/об), Затем компоненты, экстрагируемые органическим растворителем, полностью удаляют путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги 3000 об/мин в течение 10 мин и хло:. роформныи слой удаляют. Обработка протеолитическими ферментами (лизисом). Обезжиренные клетки обрабатывают протеолитическими ферментами, такими как проназа, трипсин и пепсин, Из числа указанных протеолитических ферментов проназа является наиболее подходящей для данной цели.Очистка, В поверхностный слой центрифугирования протеолитической реакционной смеси вводят осадители, такие как трихлоруксусная кислота (ТХУ) илн сульфат аммония, для осаждения белковой Фракции, Белковую Фракцию затем обрабатывают соответствующей нуклеазой для удаления составляю" щих нуклеиновой кислоты, таких как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК) в данной Фракции. После такой Ферментной обработки осуществляют повторный диалиэ.Частично очищенную белковую фрак" цию подвергают гель-Фильтрации и фракционированию сульфатом аммония, и в конечном итоге получают чистый препарат белка - белок СКР.50 Физико-химические характеристикибелка СКР.Химическая природа и характеристики растворимости: белый порошок,очень хорошо растворим в воде, а также растворим в ацетоне. При смешиваюнии раствора белка СКР с сульфатомоаммония или ТХУ на холоду (4 С) наблюдается соответственно мутность и выпадение осадка,Молекулярная масса белка СКР30000+7000, что установлено методомгель-фильтрации с использованием колонки Тоуореаг 1 НИ 55 и 25 ммоль буферного раствора трис-НС 1, содержащего 0,3 моль БаС 1 (рН 7,5).Изоэлектрическая точка белка СКРизмерена методом изозлектрическогофокусирования с использованием 57.-ного полиакриламидного геля, содержащего амфолин (рН 3,5-10), с конечнойконцентрацией 27 при 4 С, при ста-.бильном напряжении 200 В в течение,3 ч. Для электродных растворов катода 25и анода используют растворы 0,02 мольНзРО и 1 моль МаС 1 соответственно.Используют образец в количестве100 мкг, окрашивание осуществляютпосредством красителя Кумасси Вг 11"11 ап 31 ие. Изоэлектрическая точка составляет 7,9 ф 0,2;Состав аминокислоты. Образец (1 мг)суспензируют в 1 мл соляной кислоты ивводят в ампулу, эамораживают в" смесисухой лед - метанол, и вытесняют воэдух газообразным азотом (И ) в вакууме. Такое вытеснение газа повторяюттри раза, ампулу запаивают в вакууме.оПосле гидролиза при 110 С в течение4024 ч в нагревательной системе хлоргидрат удаляют путем испарения во вращательном испарителе в вакууме, и образец растворяют в 200 мкл 1/50 НС 1.Затем 50 мкл этого образца анализируют в анализаторе аминокислоты.Аминокислотный состав, мол.7.:Глицин 25,23Алании 10,98Глутамин 10,34Аспарагин 8,20Лизин 6,39Лейцин 5, 5 ЪВалин 5,41Иэолейцин 5,18Треонин 4,2355Тирозин 4,19Серии 3,46Пролин 2,62 Аргинин 2,60Фенилаланин 2,51Метионин 1,56Гистидин 1,30Цистеин 0,16Кривые электрофореза на диске, Электрофоретический анализ белка СКР (25 мкг) с использованием диска осуществляют с использованием полиакриламидного геля (7 Е полиакриламида) в буферном растворе (трис-глицине, рН 8,3) при 4 мА/гель в течение 2,5 ч, Характерная для белка кривая с резким максимумом исследуемого образца получена на расстоянии 4,2+0,2 см от анода.Физиологические характеристики. Белок СКР обладает способностью понижать содержание холестерина в крови млекопитающих животных при вводе его через рот. Такая активность является устойчивой в пределах температуры от -80 до +115 С и рН от 4,1 до 10,9 при хранении белка СКР.Фармакологические активности белка СКР.Фармакологические эффекты. Анти" атеросклеротическое лекарство, кото" рое состоит из белка СКР, может вызвать чрезвычайно сильное понижение холестерина крови в организме млекопитающих животных. В связи с этим данное лекарство используется в качестве терапевтического или профилактического средства от заболеваний, непооредственно связанных с атеросклерозом, гиперлипидемией, гиперлипопротеинемией, ксантоматозом, холелитиазом, гипертонией, диабетами и другими болезнями.Препарат, соответствующий изобретению, может использоваться для млекопитающих животных, его вводят через .рОт, внутрибрюшинной или внутривенной инъекцией и другими способами. Доза одного приема препарата составляет примерно 1 мкг - 1 г на 1 кг массы больного, Предпочтительно введение через рот примерно 0,1-1,00 мг на 1 кг массы. Может быть выбрана любая форма препарата: в виде раствора в физиологическом солевом раство" ре и в другом растворителе, в виде инъекционно вводимого препарата, в виде порошка, приготовленного путем лиофилизации и другими способами, в виде свечей, желудочных таблеток с покрытием, подъязычных таблеток, гра1423002 нул, капсул и т,д вместе с соответствующими носителями (например, крахмалом, декстринам), раэбавляющимп основаниями (например, карбанатам каль 5ция, лактоэай), раэбанителями (напри"мер, физиологическим соленым раствором, дистиллированной водой) и т.д.Острая токсичность. ЬЭо белкаСКР составляет более 802 мг/кг массыпри ннутрибрюшинной инъекции в организм жпней. Данный белок в основномявляется нетаксичным при вводе черезрот.П р и и е р. Приготовление и очист 1ка белка СКР.Бактерии 81:гереососспз ГаесшшАВЧ 1009 (ГЕКИ ВР) инокулируют в2 л питательного бульона Кояоза сконечной концентрацией 110 бактериальных клеток на 1 мл, Инакулираванную питательную среду инкубируютпри 37 С н течение 10 ч без перемешивания в аэробных условиях, в результате чего получают 10 бактериальных 2 бклеток на 1 мл среды культивирования,Бактериальные клетки собирают путемнепрерывного центрифугирования соскоростью вращения центрифуги12000 об/мнн, промывают фиэиологичес- З 0ким соленым раствором (0,85 ИаС 1)и суспензируют н том же растворе, по"лучая 100 мл клеточной суспензии концентрацией 2 10 ц/мл.Суспензию бактериальных клеток под-ЭВвергают термической обработке при115 оС в течение 10 мин и трехкратнаобрабатывают смесью хлороформ " метанол (2:1 об,/об,) для удаления жиров.Обезжиренную бактериальную суспензию центрифугируют са скоростью нращения центрифуги 3000 об/мин в течение10 мин, и нижний слой, например хлороформный, удаляют. Водный слой используют в качестве исходного материа-,.ла для последующих этапов очистки.Исходный материал обрабатывают20 мг проназы (протеазы типа Х 17). в100 мл Фосфатного буФера (рН 7,8),содержащего 00015 моль СаС 1 при47 С в течение 24 ч, и последующуюобработку 10 мг проказы асуществля"ют при тех же условиях,Продукт, обработанный проназой,разделяют на фракции пу"гем центрифугирования со скоростью вращения цент"рифуги 3000 аб/мин в течение 10 мин.Во всплывшую фракцию добавляют 1/9объема 100-ной (масаб.) ТХУ, затем 6ее выдерживают при 4 С н течение 3 ч при перемешинании и центрифугируют со скоростью вращения центрифуги 3000 об/мин н течение 10 мин, получая осажденную и всплывшую Фракции. В осажденную фракцию вводят такой же объем 10 ,-ной ТХУ, и данную процедуру повторяютПолученный осажденный продукт промывают три раза этиловым эфиром для удаления ТХУ, растворяют и 50 мл дистиллированной воды, нейтрализуют 1 н, ИаОН, диалиэируют с целью полного удаления ТХУ и, наконец, центрифугируют, Получают 345 мг (на сухую массу) осажденной фракции.В полученную осажденную Фракцию (345 мг) вводят 5 мл (О, 1 моль) трисацетатнога буфера (рН 8,0), 1 мп (О, 1 моль) ацетата магния и 0,06 мл дезоксирибануклеазы (2 мг/мп деэаксирибануклеазы 1) и инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Затем реакционную смесь диализируют с использованием дистиллированной воды в качестве растворителя целлюлозной трубки в течение трех дней, причем деализирующиеся вещества имеют молекулярную массу меньше 3500, Диализиронанную фракцию выпаринают досуха. Полученный продукт далее суспенэируют в 5 мл (0,05 моль) ацетатного буфера (рН 4,6), содержащего 440 мол,ед, рибонуклеазы Т, инкубируют при 37 С в течение 3 ч и ди- ализируют с использованием дистиллированной воды в качестве растворителя. Диализированная Фракция обозначается как очищенная Фракция 1 (молекулярная масса20000, масса сухой массы 285 мг)Очищенную Фракцию 1 вновь обрабатывают рибонуклеазой Т и диализируют с получением очищенной фракции П (масса на сухую массу 274 мг). Фракцию 11 подают в хроматографическую колонку Тоуореаг 1 НУ 55, в которой используется 25 ммоль трис-НС 1 буфер (рН 7 у 5) р содержащий О, 3 моль ЯаС 1Порцию, элюиронанную после 67 мл объема элюирования, обрабатывают сульфатом аммония (насыщенность 553), и очищенную фракцию 111 (масса сухой массы 205,5 мю) получают из поверхностнога слоя жидкого продукта Фракционирования сульфатом аммония.Поскольку фракция 111 содержит следовые количества сахара, то ее треххратно обрабатывают 101-ной ТХУ и диализируют при тех же условиях.Т а блица 1 Штамм Характеристика ЯЭЧ АПЧ 1009 9001(ВР)(ВРЮЧ АЭЧ АЭЧ АПУ АЭУ2003 10001 3001 7001 8001ВР(ВР) (ВР- (ВР) (ВР" 302)300 Сфероид Форма клеткиОкраска по Граму Гемолиэ Рост при температу- оС,10 50 Термическая устойчивость при 60 Св течение 30 мин Рост в питательнойсреде культивирования при рН 9,6 Ослабляющая способность метиленового синего Разжижение желатина 7Получают очищенный белок СКР (масса сухой массы 197,3 г).В табл. 2 показаны выход и колччества белка по методу Лоури РНК 5 микробным методом, ДНК-методом с использованием дифениламина и сахаров с использованием фенола НБО в каждом процессе. Приведенные в табл. 2 значения представляют собой массу сухой 10 массы.Удельная активность, приведенная в табл. 2, показывает способность каждой фракции снижать холестерин у обычных крыс на единицу массы крысы. Белок СКР может быть выделен и очищен с использованием других указанных бактериальных штаммов.Использование изобретения позволя ет получать белок, обладающий способностью снижать содержание холестерина в крови млекопитающих животных. Способ получения белка, понижающего содержание холестерина в крови мле" копитающих животных, заключающийся в том, что штамм Бсгергососсцв Каес 1- цш ГЕКМ ВР, Бггергососсцв Гаеса 11 в ГЕКИ ВР, Бггергососсцв ачьцш ГЕКМ ВР, БСгергососсцв ва 11- уа 1 дцв РЕКИ ВР, Бггергососсцв дцгапв ГЕКМ ВР, Бйгергососсцв пд. - г 1 в ГЕКИ ВР1 или Йгерйососсцв еяцпцв ГЕКИ ВРкультивируют в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим отделечием полученной биомассы, лизисом ее последовательно термической и ферментативной обработкой, отделением полученного осадка, обработкой его рибонуклеазой и очисткой целевого продукта ди" ализом,1+ желчь (403) Продуктивнмиах а амдролиз гиппурой кислоты ост в питательной рйде, содержащей: ллуритв + ТТС(в) к и м е ч а н и е. х, - 2,3,5"трифенилтетразолийхл(й) ано ост в питательнойреде, содержащейИаС 1 (6,5 Х) Получение кислотиз углеродного иточника:глюкоза орбит нтигенная гр ЮЧ10001ВР1423002 12 Таблица 2 Фракция Выход Белок РНК ДНК Сахар 34 9 436 6,3 1,2 05,5 202,6 Следы След 2,9 7,3 197,3 Белок СК Следы ехред Л.Сердюкова орректор В.Бутяг Редак Рогулич Подписное Тираж 520 ВНИИПИ Государственног по делам изобретени 13035, Москва, Ж, РаушЗаказ 487 изводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, .4 ОсадокОчищеннфракция 285 260, 1 11, 3 274 258,3 3,6 комитета СССР открытиикая наб., д,Удельнаяактивность 1 ь 1 1,8