Способ получения антибиотика

фмбнмотека НБ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ5 О 168 О Союз Советских Социалистических Республик, Кл."- С 120 9 2) Заявлено 22.12.72 (21) 1870482/28-13 23) Приоритет - (32) 23.12,7131) 211231 (33) США Государственнын комитет Совета Министров СССР по делам изобретенийи открытий(088.8) но 30,01.76. Бюллетень4 ублик а опубликования описания 09.04 72) Авторы изобрете пя Иностранцы Хамилл и Марвин Мартин(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕ 2зированной воде и суспензии высевают на питательной агар в чашках Петри, Затем их инкубируют при 25 - 35 С до тех пор, пока не достигнут роста, далее колонии микроор ганизмов, производящих антибиотик, переносят на косой агар стерильной платиновой петлей. Косой агар инкубируют, чтобы обеспечить необходимый прививочный материал для получения антибиотика.10Микроскопическое строение,характеристика культурыи физиология Микроокопичеокимеют спиральную(1,00 - 1,25 К 0,50 -виде цепей от 10 дХарактеристикасреде2 растетцелий светлый,воздушный мицелцвета.Растворииый пНа аитательнойно. Субстр атныйный мицелий очеспоруляция, белаясветло-желтого цв опорофоры овальную ечаются в 25 Изобретение относится к еской промышленности.Предлагаемый способ получения антибиотика, не описанный в патентной и доступной специальной литературе, заключается в том, что культуру Ягер 1 отпусеэ а 1 Ьцз 1 чКК 1. 3883 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащий источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами.Новый антибиотик получают путем выращивания .нового штамма актиномицета в условиях культивирования микробов в глубине аэробной питательной среды.Актиномицет, используемый при получении антибиотика, идентифицирован как штамм 51 гер 1 отпусеэ а 1 Ьцэ (Козэ 1 - Ропа) Юа 1 сзгпап и Неппс 1.Микроорганизм депонирован Северным Отделом использования, исследования и развития, сельскохозяйственной исследовательской службой, сельскохозяйственным департаментом США, Пеория, Иллинойс. Его номер КК 1. 3883, Штамм выделен из образцов почвы, собранной в Кюрасао (Рц 1 сЬ Ап 1111 ез).Для выделения штамма часть почвенных образцов суопендируют в стерильной деиониое строение:форму, споры -1,00 мкм) и встро 50.культуры: на питательной обильно. Субстратный мижелто-коричневый, Хороший ий и опоруляция белого игмент отсутствует.среде3 растет прекрас.мицелий белый, Воздушнь хороший, наблюдаетсяс разбросанными зонами ета.На питательноЙ среде М 4 растет обильно, Субстратный,мицелий бледно-желтый. Обильный воздушный мицелий и белая споруляция. Светко-,коричневый пигмент отсутствует.Яблочнокислый кальций. Рост хороший, 5 Субстратный мицелий светло-желтого цвета. Воздушный мицелий умеренный и споруляция бледно-желтого цвета, Растворимый пигмент до наличия светло-желтого цвета отсутствует, 10Питательная среда Чапека, Рост хороший, су бсср атный мицелий светло-желтого цвета. Воздушный мицелий бледно-желтого цвета, споруляция, Растворимый пигмент отсутствует. 15Томатная паста с овсяной мукой, Рост обильный, Субстратный мицелий бледно- желтого цвета, Хороший, воздушный мицелий и споруляция желтовато-серого цвета, Растворимый пигмент отсутствует. 20физиологияХорошо растет и опорулирует при 26 - 37 С. Не растет лри 43, 49 или 55 С. Снятое молоко не свертывает, наблюдается поверх ностное кольцо роста. Желатин разжижает полностью после 21 суток. Легкое восстановление нитратов после 21 суток.Питательная среда может быть любой, однако предпочтительными являются среды, 30 которые содержат легко усвояемый источник углерода, такой как глюкоза, маннит, фруктоза, растворимый крахмал, декстрин, меласса, желтый сахар. В среду вводят источник азота, например, овсяную муку, мясной экс трат, гидролизированный казеин, замоченные зерна, дрожжевой экстракт, соевые бобы, пептоны (мясные или соевые).В питательную среду могут быть включены минеральные соли, например, дающие 40 ионы калыция, магния, натрия, калиякобальта, хлора, сульфата или карбоната, и ростовые вещества, такие как дрожжи или дрожжевые экстракты.В питательную среду добавляют также 45 микроэлементы.Микроорганизм растет при температуре 26 - 40 С, предпочтительно между 26 - 30 С, рН питательной среды находится в пределах 6,5 - 7,2, Образование антибиотика происхо дит от двух до пяти дней.Небольшие количества антибиотика получают в колоах, а поверхностную культуру - в бутылках, Для приготовления больших количеств антибиотика выращивают культуру 55 микробов в глубине аэробной питательной среды в больших резервуарах.Чтобы избежать задержки в процессе производства антибиотика, используют вегетативную форму микроорганизма для посева в 60 питательной среде в производящих резервуарах. Вегетативный прививочный материал микроорганизма вначале приготавливают путем инокуляции, а затем асептически переносят его в резервуары для получения в боль ших количествах. Для производства прививочного материала вегетативной формы может быть использована та ке питательная среда, что и для получения антибиотика.Культуру микробов в глубине аэробной питательной среды продувают стерильным воздухом - 0,3 объема воздуха в 1 мин на 1 объем питательной среды.Концентрацию активности антибиотика в питательной среде определяют во время ферментации путем тестирования образцов питательной среды на их подавляющую активность против роста известного микроорганизма.При разделении и очищении антибиотика на активные компоненты А и В могут быть использованы различные методы, например, солевая экстракция, применение адсорбентов и колоночной хроматографии.Активный компонент А, выделяемый из смеси антибиотика, представляет собой белую, кристаллическую смешанную натрий- калиевую соль, имеющую точку плавления 161 в 1 С.Смешанная натрий-калиевая соль антибиотика не растворима в воде, слегка растворима в метаноле, растворима в простом эфире и в сложных эфирах, таких как метилацетат, этилацетат, в кетонах, таких как ацетон и метилэтилкетон, в хлороформе, бензоле и толуоле.Компонент А стабилен в растворе при величине рН -4,0 и температуре до 27 С,Свободная кислота компонента А представляет собой белое кристаллическое твердое вещество, плавящееся при 97 - 99 С. Элементарный состав этой кислоты следующий: 63,31 О/о углерода, 8,83 О/о водорода и 28,03 О/о кислорода.Масс-спектральные данные компонента А указывают на приблизительный вес 834. Молекулярный вес натриевой соли составляет -874, поэтому молекулярный вес свободной кислоты равен - 852,Смешанная натрий-калиевая соль антибиотика компонента В представляет собой белое кристаллическое вещество, плавящееся при 170 - 172 С. Растворимость и стабильность компонента В аналогичны образцам смешанной натрий-калиевой соли компонента А. Кислотная форма компонента В - это белое кристаллическое твердое вещество с точкой плавления 122 - 124 С. Элементарный состав: 60,49/о углерода, 9,15"/о водорода и 31,32/о кислорода.Молекулярный вес натриевой соли компонента В, вычисленный из данных по титрованию, составляет - 877. Молекулярный вес свободной кислоты компонента В равен - 855.Новый антибиотик обладает ингибирующим действием на рост микроорганизмов, как бактерий, так и грибков, патогенных для животных и растений, и полезен при подавлении роста таких микроорганизмов.При испытании тестом дисков оба компонента антибиотика показали видимые зоны нцгпбирования против следующих микроорганизмов: Вас(11 цз зи%11 з, МусоЬас 1 ег(цт ачсегп Яагс 1 па 1 ц 1 еа.Компонент В при испытании в вирускультивируемой среде проявляет активность против вируса коровьей оспы, поливируса 111, вируса комариной лихорадки Семлики, вируса герпеса и вируса гриппа Япония 305.Антибиотик предотвращает развитие некоторых заболеваний растений, Препарат из смеси компонснтоз А и В при разбрызгивании эффективен против мучнистой росы бобовых пастений и корончатого галла помидоров. Грц примен ции на инфицированных растениях с помощью разбрызгивания или смачивация указанная смесь активна и против вирусных заболеваний растений - вируса южной мозаики фасоли и вируса карликовости маиса.Антибиотик обладает также инсектицидной активностью. Например, при контакте с растворами компонента А или компонента В антибиотика при концентрации 100 частей на тысячу, гибель домашних мух достигает 887 о, при концентрации 250 частей на тысячу - 99 ).Важным свойством антибиотика является его способность предотвращать развитие кокцидиоза у домашних птиц.Антибиотик (и его компоненты) улучшает усвоение углеводоров у животных, т. е. повышает эффективность их вскармливания, Он влияет на состав свободных летучих жирных кислот в рубце, в частности увеличивает количество пропионата, доступного для обмена у жвачных.Другим важным свойством антибиотика является способность образовывать комплексы с моновалентными катионами. В экспериментах по определению ионной специфичности компонент А показал специфичность к ионам калия и рубидия, в то время как сам антибиотик проявляет специфичность к ионам натрия и калия. Использование же ионноспецифичных электродов является важным во многих химических анализах,П р и м е р 1. Ферментация методом встряхивания.Культуру, производящую антибиотик, приготавливают и поддерживают на косом агаре, имеющем следующий состав (г):Декстрин 700 10 И-Х амин А 2 Мясной экстракт 1Дрожжевой экстракт 1 Атар 20Деионизированная вода 1 (л),Косой агар инокулируют антибиотикопроизводящей культурой КК 1 Ц. 3883 и инкубируют при 30 С в течение 4 - 6 дней. Спорулированный косой агар покрывают небольшим количеством стерильной деионизированной воды и осторожно соскабливают, чтобы полу 20 2,00 1,00 0,01 20,001 (л) Раствором едкого натра рН питательнойсреды доводят до 7. После стерилизации паром (путем автоклавирования) в течение 45 30 мин рН питательной среды составляет 6,9.Косой агар инокулируют антибиотикопроизводящей культурой 1 чКК 1. 3883 и ицкубируют при 30 С в течение 10 дней. Спорулированный косой агар покрывают небольшим ко личеством стерильной деионизированной воды и осторожно скоблят для получения водной суспензин, содержащей споры,Каждую косую среду используют для инокуляции шести сосудов (объем 250 мм), в каждом из которых находится 50 мл стерильной вегетативной питательной среды следующего состава (г):Глюкоза 15,0 Соевая крупа 15,0 60 Замоченные зерна 10,0К аС 1 5,0 СаСО, 2,0 Водопроводная вода 1,1 (л).Раствором едкого натра рН питательной 6 среды доводят до 6,5, и она не изменяется чить водную суспензию, содержащую споры, 1 мл полученной спороносцой суспензпи используют, чтобы инокулировать 100 мл стерильной вегетативной питательной среды, 5 имеющей следующий состав (г):Глюкоза 15 Соевая мука 15 Замочецные твердые зерна 5 СаСОз 2 10 К аС 5Водопроводная вода 1 (л).Инокулированную вегетативную питательную среду инкубируют 24 - 48 час при 30 С на обратном шейкере. Затем порцией (5 мл) полученной культуры цнокулируют 100 мл производящей питательной среды, находящейся в сосуде Ег 1 епгпеуег (емкость 500 мл) и имеющей следующий состав (г):Соевая мука 15 Казеин 1 КаМОз 3 Сироп из глюкозы 20 Водопроводная вода 1 (л).Ицокулированную питательную среду оставляют для ферментирования на 42 - 72 час прн 25 - 30 С в ротационном шейкере (250 об/миц).П р и м е р 2. Резервуарная ферментацияантибиотика.З 0 Культуру, производящую антибиотик, приготавливают и поддерживают на косом агаре, имеющем следующий состав (г);Декстрин 10,00 Дрожжевой экстракт 1,00 З 5 Казеин, гидролизированныйферментамиМясной экстрактСаСз 6 НОАгар40 Деионизированная водаЗаказ 668/15 Изд, Ма 1072 Тираж 551 Подписно. ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4,5Сапунова, 2 Типография, пр. при стерилизации (путем автоклавирования) в течение 30 мин,Инокулированную питательную среду оставляют для ферментации на 72 час при 30 С на ротационном шейкере (250 об/мин), Порцию (10 мл) полученной культуры используют для инокуляции 200 мл стерильной питательной среды второй стадии роста, содержащейся в литровом сосуде и имеющей указанный выше состав.Инокулированную питательную среду оставляют для ферментации на 30 час при 30 С на обратном шейкере (250 об/мин), Порцией (200 мл) полученной культуры инокулируют 25 л питательной среды, находящейся в 40- литровом ферментаторе и имеющей состав (%):Глюкоза 2,50 Соевая крупа 1,50 Казеин, гидролизированныйв кислой среде 0,10Мел асса 0,30 СаСОз 0,25 Водопроводная вода 95,35После стерилизации в автоклаве в течение 30 мин рН питательной среды составляет 7,2.Инокулированную питательную среду насыщают воздухом (скорость 0,3 объема воздуха на 1 объем культуры в 1 мин) и перемешивают при помощи конвенционной мешалки (350 об/мин).Фермснтацию проводят при 30 С а течение 5 дней.Пример 3. Изоляция антиДиотической смеси,92 л ферментативного бульона, полученного при ферментации антибиотика, фильтруют при помощи мелкозернистого материала, образующ го фильтрующий слой. Лепешку мицелия с,спендируют в 25 л метанола, и смесь энергич 1:о перемешивают 30 - 60 мин, фильтруют, фильтрат концентрируют, чтобы удалить метанол. Полученную таким путем водную среду смешивают с фильтратом первоначального ферментационного бульона.Затем экстрагированную лепешку мицелия суспендпруют в 25 л этилацетата, и суспензию пе 1,емешивают 30 - 60 мин. Смесь фильтруют и лепешку мицелия отбрасывают. Профильтрсванный бульон экстрагируют дважды половин й объема этилацетата, Использованный бульон отбрасывают. Полученные этила 5 10 15 20 25 30 35 40 цетатовые экстракты смешивают с этилаце. татовым экстрактом лепешки мицелия,Объединенные экстракты концентрируют до. получения маслянистого остатка, который растворяют в 1 л хлороформа, Раствор хлороформа пропускают через колонку питтсбургского угля, заполненного в хлороформе. Колонку промывают 20 л хлороформа. Вытекающий хлороформ и промывку смешивают и концентрируют до сухого остатка.П р и м е р 4. Разделение антибиотика на активные компоненты А и В.ЗО г сырой антибиотической смеси, полученной согласно описанному выше методу, растворяют в смеси бензола и этилацетата 9;1. Раствор пропускают через колонку, заполненную силикагелем. Адсорбент предварительно промывают смесью бензола с этилацетатом (9:1). Далее колонку промывают 6 л смеси бензола с этилацетатом (9: 1); вытекающую и промывную жидкость отбрасывают, Затем колонку элюируют смесью бензола с этилацетатом (4: 1), Элюат собирают в несколько фракций; компонент А выходит из колонки в первых фракциях, а компонент В - собирается в последующих.Идентификация антибиотика в отношении колоночных фракций определяется с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии. Колоночные фракции, содержащие тот же антибиотик, смешивают и выпаривают в вакууме для получения соответствующих индивидуальных антибиотиков в достаточно чистой форме.Активный компонент А кристаллизуют путем растворения аморфного антибиотика в теплом простом эфире, Антибиотик кристаллизуют как смешанную натрий-калиевую соль с точкой плавления 163 - 165 С. Выход 11,8 г,Активный компонент В также кристаллизуют из эфира в форме смешанной натрий-калиевой соли с точкой плавления 170 в 1 С.Выход 5,3 г. Формул а изооретенияСпособ получения антибиотика, о т л и чаю щ и й с я тем, что культуру Ыгер 1 огпусез а 1 Ьцз МКК 1. 3883 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта и разделением на активные компоненты известными приемами,