Способ определения каталазы в крови

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУбЛИН И 4 С 01 И 33/48 ОПИСАН ТЕНИЯ ЗО биологи жевв В 20 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТНОСИТ(56) Крайнев С.И. Много определения кности интактных эрности и каталитичелизата в одном обрраторное дело, 196Асатиани В.С. Фанализа: Наука, 19 етодика параллельталазной активтроцитов, активкой емкости гемозце крови, - Лабом 9, с.562-563. рментные методы 9, с. 611-612,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТАЛАЗЫ ВКРОВИ(57) Изобретение относится к техниопределения активности ферментов и В:Ь,Щй 13 ", ц ИЗДИТ-,; тможет быть использован ческих исследованиях, а так ете ринарно-медицинской практике. Целью изобретения является повышение точности определения каталазы. Способ включает отбор крови, ее разведение, инкубирование, с перекисью водорода, добавление мета-фосфорной кислоты, фильтрование, введение в фильтрат раствора восстановленного глутатиона и хромогенного реактива следующего состава, об.7: 4 Е-ный водный раствор молибденовокислого аммония 45-50Э ледяная уксусная кислота 2025;20 Е- ный водный раствор силиката натрия 2-4; вода-остальное, с последукюцим колориметрированием полученной смеси. 4 табл.20-25 10-4 7 Изобретение относится к технике определения активности Ферментов и может быть использовано в биологических исследованиях, а также в ветеринарно-медицинской практике.Целью изобретения является повышение точности определения каталазы.Для определения каталазы готовят образец, инкубируют его с перекисью 10 водорода, определяют неиспользованную перекись водорода. Последнюю операцию проводят путем добавления в инкубационную среду 10%-ного водного раствора мета-ФосФорной кислоты,15 Фильтрования, приливания к фильтрату 0,4%-ного водного раствора восстановленного глутатиона и колориметрирования смеси после добавления хромогенного реагента следующего со стана, об,%:4%-ный водный раствормолибденовокислогоаммония(+вода), содержащая350-3 мкМ перекисиводорода10%-ный водный раствор мета-ФосФорнойкислоты 8-15400,4%-ный водный рас"твор восстановленного глутатиона 5-15Хромогенный реагент 40-60П р и м е р. 1 мл разведенной в 2500 раз гемолизированной крови поросят переносят в пробирку и нагрео вают на водяной бане при 37 С в течение 3 мин, а затем добавляют 1 мл 3 мМ раствора перекиси водорода, подогретого до 37 С, Через 1 мин реакцию останавливают приливанием 1 мл 10%-ного раствора мета-Фосфорной кислоты. Фильтруют, к 1,5 мл Фильтрата приливают 0,5 мл 0,4%-ного раствора восстановленного глутатиона, а затем - 3 мл хромогенного реагента. Спустя 1- 12 ч пробу колориметрируют при б 50-700 нм, Параллельно ставят слепую пробу (вместо 1 мл перекисиводорода - 1 мл воды). Количествоперекиси водорода определяют по предварительно построенному калибровоч"ному граФику, который при концентрациях перекиси водорода от 0 до 3 мкМпредставляет собой прямую линию.В целях приготовления хромогенного реагента к 50 мл 4%-ного водного раствора молибденовокислогоаммония %14) МО.,О д4 Н 0) приливают 25 мл ледяной уксусной кислоты,а затем, после тщательного перемешивания, добавляют 3 мл 20%-ного водного раствора силиката натрия(Иа БхО 9 Н 0) и водои доводят до100 мл.Активносгь каталазы рассчитываютпо ФормулеА = К(Си Сн)где А - активность, мкМ Н О /минмлкрови;С - исходное количество Н 0мкМ (С,=З);.)С- количество неиспользованнойНО, мкМ,К - разведение крови (К=2500).В табл. 1 представлены сравнительные данные определения перекиси водорода, добавленной в инкубационнуюсреду, включающую препарат гемолизо".ванной крови поросят, который предварительно инактивировали кипячением.По сравнению с известным предлагаемый способ более точен, он имееттакже лучшую повторяемость результатов,В табл, 2 представлены данные поопределению пределов состава хромогенного реагента.В табл. 3 приведено определение пределов состава колориметрируемой смеси.В табл. 4 представлены данные по изучению пределов концентрации перекиси водорода в инкубационной среде.Формула изобретенияСпособ определения каталазы в кро" ви, включающий отбор крови, ее разведение, инкубирование с перекисью водорода, определение количества непрореагировавшей перекиси водорода, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности определения, в инкубационную среду добавляют растворз 1399682 мета-фосфорной кислоты, смесь фильтруют и к фильтрату добавляют раствор восстановленного глутатиона и хромогенный реактив следукщего состава, об.й:547 ный водный раствормолибденовокислого 45-50 20-25 2-4Остальное Т а б л и ц а 1 Известный Предлагаемый Фактическое соРазницамеждупарад.,7 отклонения от фактическогосодержания НайденоН О ,мкМ Х отклонения от фактическогосодержания Разницамежду парал а 2 Найдено Н О,мк держание Н О ,мкМ 5,2,1 1,70 О86,4 а бли Сос Содержание компонентов в смеси 1 об.Х компоненто 4 ( 56 Аммоний молибд слый,4 Ж-ный створ1399682 Продолжение табл,2 Состав компонентов вода 42 37 32 22 81,Э 100 50 50 50 50 50 50 20 10 15 30 Э 337 32 27 22 Выпадениеосадка 50 50 50 50 50 50 25 2 3.23 22 10 24 19 Вода 53,Э 96, 1 100 Таблица 3 Состав компонентов 20 20 20 20 10 15 20 Определено перекисиводорода,% Аммоний молибденовокислый, 4%-ный водныйрастворКислота уксусная, ледя- ная Силикат натрия, 20%-ный водный растворВода Определено перекисиводорода,% Аммоний молибденовокислый, 4%-ный водныйраствор Кислота уксусная, ледяная Силикат натрия,20%-ныйводный раствор Определено перекисиводорода,% Инкубационная среда Мета-фосфорная кислота 10%-ный водный раствор Содержание компонентов в смеси, об.Х 2 3 4 5 б 89,5 94,1 96,9 98,7 69,9 84,4 93,2 98,2 100 942 913 873 Содержание компонентов .в смеси, об.% 1 23 4 5Состав компонентов 10 10 10 О 10 50 50 50 50 Хромогенный реагент 50 15 12 Вода 10 О. 96,7 87,6 100,0 98,1 95,2 20 20 20 20 20 10 10 10 10 10 20 50 50 Хромогенный реагент 50 50 10 Вода 0 83,3 97,2 20 20 20 20 20 10 10 10 10 1.0 10 10. 1 О 10 Хромогенный реагент 30 20 40 50 60 0 Вода 40 30 20 10 88,8 95,7 97,7 Глутатион восстановленный, 0,4%-ный водныйраствор Определено перекисиводорода,% Инкубационная среда Мета-фосфорная кислота, 10%-водныйраствор Глутатион восстановленный, 0,4%-ный водный раствор Определение перекисиводорода,% Инкубационная среда Мета-фосфорная кис, лота, 10%-ный водный раствор Глутатион восстановлен-.ный, 0,4%-ный водныйраствор Определено перекисиводорода,% Содержание компонентов .в смеси, об.Х 12 3 :4 5 100,0 97,4 96,4 100,0 99,6399682 1 О Таблица 4 Концентрация перекисиводорода, мкм 1,О 1,5 2,0 3,0 4,0 0,5 0 Отклонение от линейной зависимости,Е 6,0 10,7 0 0 0 Составитель И. ТарееваТехред А.Кравчук Корректор М, Демчик Редактор М. Бандура Заказ 2662/46 Тираж 847 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 ФПроизводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4