Способ получения белкового антигена фасциол

(5 АНИЕ ИЗОБРЕТ ВИДЕТЕЛЬСТВ К АВТОРС Намье франца ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(71) Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО АНТИГЕНА ФАСЦИОЛ, включающий экстрагирование антигенов из гельминтов и их очистку методом аЬЪинной хроматографии с сорбцией белкового антигена на связанном с Аенилаланином нерастворимом комплексе и отмыванием несорбируемых элементов экстракта. с последующим его элюированием, о т- . л и ч а ю щ и й с я тем, что, - с целью повышения степени очистки и предотвращения потери белкового антигена асциол, в качестве нерастворимого комплекса используют СЯВгактивированную сеФарозу 4 В, а сорбцию й белкового антигена фасциол и отмыва- . - ние несорбируемых элементов экстракта проводят при рН 3,8-3,9, причем связавшийся с сорбентом антиген С: элюируют при рН 7 0-8 О11595 79 том. 50 55 1Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к проблеме получения антигенов из гельминтов, а именно из Фасциол, паразитирующих в печени сельскохозяйственных животных и человека.Известен способ получения одного из антигенных компонентов Фасциолбелкового антигена невысокого молекулярного веса (27 500 дальтон-) комби.10 наций методов гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и препаративного электрофореза 1 .Недостатком данного способа является сложность (многоэтапность) 15 процесса выделения и присутствие в препарате, кроме иммунологически активного материала, примесей других белков и полипептидов, Кроме того, такой процесс очистки сопровождает ся потерей антигенной активности вследствие распределения множественных Форм антигена по разным Фракциям (антиген оказался не однородным веществом, а гетерогенной груп пой иммунологически близких, но различающихся по Физико-химическим свойствам компонентов). В результате конечный продукт представляет собой одну из Фракций, куда попадает лишь часть исходной антигенной активности и он не свободен от сопутствующих примесей.Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения35 белкового антигена из гельминтов, в частности шистосом, включающийэкстракцию антигена, очистку на сефадексе Ги очистку методом аффинной хроматографии на агарозе, к которой в качестве лиганда присоединен Фенилаланин, избирательно сорбирующий Фермент из гетерогенной смеси веществ ири рН 3,5-4,5 2 . При этом используется то обстоятельство, что белковый антиген шистосом является протеолитическим ФерменНедостатком известного способа является проведение десорбции Фермента либо снижением рН до 2-3, либо его повышением до 4,5-5,5.Для выделения низкомолекулярного белково го антигена Фасциол, также оказавшийся протеиназой, такие условия десорбции неприемлемы, так как при слишком низких рН появляется опасность денатурации антигена, а рекомендуемые более высокие его значения (рН 4,5-5,5) находятся в области, близкой к изоэлектрической точке антигена (5 рН 6), что также снижает его устойчивость. Кроме того, рекомендуемые значения рН,не являются оптимальными для проведения иммунологических реакций, Наличие предварительного этапа выделения Фермента на сефадексе Гусложняет процесс очистки.Цель изобретения - повышение степени очистки и предотвращение потерь белкового антигена Фасциол.Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения белкового антигена фасциол, включающему экстрагирование антигенов из гельминтов и их очистку методом аффинной хроматографии с сорбцией белкового антигена на связанном с фе нилаланином нерастворимом комплексе и отмыванием несорбируемых элементов экстракта с последующим его элюированием, в качестве нерастворимого комплекса используют СЫВгактивированную сефарозу 4 В, а сорбцию белкового антигена Фасциол и отмывание несорбируемых элементов экстракта проводят при рН 3,8- 3,9, причем связавшийся с сорбентом антиген элюируют при рН 7,0-8,0. П р и м е р 1. Для получения сорбента со сродством к антигену-протеиназа берут 7 г препарата СИВг-активированной сефарозы 4 В, приготовленной в лабораторных условиях из нейтральной сефарозы 4 В (лучше использовать коммерческий препарат активированной сефарозы), суспендируют его в 0,001 М НС 1 и многократно промывают тем же раствором на стеклянном Фильтре из расчета 200 мл/г. Полученную суспензию геля смешивают с 50 мг Фенилаланина, предварительно растворенного в 10 мл 0,1 М ИаНСО с добавлением 0,5 М ИаС 1 (можно использовать и другой, не содержащий аминогруппы, щелочной буфер). Смесь инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре и при постоянном помешивании (нельзя использовать магнитную мешалку). За это время заканчивается ковалентное связывание фенилаланина с нерастворимой матрицей. Контролем окончания реакции является поглощение гелем растворенного Фенилаланина,50 з 59579регистрируемое спектрофотометрически .их удаления необходимо собрать не по снижению оптической плотностименее 20 Фракций элюата объемами по раствора. После этого гель промы- . 1,5 мп (Фиг. 1, первый пик). Элюцию вают добавлением раствора О, 1 М сорбцировавшегося на геле антигеЯаНСО/0,5 М ИаС 1. Надосадочную5 на-протеиназы проводят другим бужидкость декантируют и проводят бло- Ферным раствором - 0,05 М трис-НС 1/ кирование оставшихся активных групп 0,5 М ИаС 1 с РН 8,2 (Фиг. 1, второй добавлением 50 мл 0,1 М трис-НС 1-бу- пик). Можно использовать буфер Фера с РН 8 (можно использовать ра- другой природы с близкими значествор другого вещества, содержа ниями РН.щего аминогруппы, например, этанол- Фракции, элюируемые в таких амина), Смесь непрерывно перемеши- условиях проявляют антигенную и вают в течение 2 ч, затем гель пе- протеолитическую активность имевФ реносят на стеклянный Фильтр и про- шуюся в исходном препарате, в то времывают щелочным (О, 1 М ИаНСО/0,5 М 5 мя, как Фракции, соответствующие ИаС 1), а затем кислым буфером. В ка- первому пику, такой активностью не честве кислого буфера используют обладают. Она может иметь здесь мессмесь. 0,1 М лимонной кислоты 0,2 М то лишь в случаях, когда величина Иа 2 НРО и 0,5 М ЯаС 1 (РН 3,8). Мож- хроматографируемого образца превыно использовать ацетатный или 20 шает емкость сорбента, Последнее на другой буфер с блиэким РН. Для. качество очистки антигена не отражаполного удаления примеси веществ, ется, а приводит лишь к излишним понековалентно связанных с гелем, терям. Для определения антигенной проводят не менее пяти таких циклов активности элюата в реакции иммупромывания (присутствие в щелочных 2 нодиффузии кислые Фракции сооти кислых буферных растворах 0,5 М ветствующие первому пику, нейтралиэоИаС 1 обязательно). вали прибавлением к каждой по 1 млПолученный продукт (8 мл сорбента . щелочного буфера. Для сравнимосимеющего в качестве лиганда фенил- ти результатов иммунологического анааланин) упаковывают в хроматогра- З 0 лиза к щелочным Фракциям, соответстФическую колонку (1 см х 20 см) и вующим второму пику, также добавляли промывают рабочим буфером, содер- по 1 мл щелочного буфера. жащим 0,5 М ИаС 1 (РН 3,8). Результаты количественного иммуВ качестве образца для проведения нологического анализа исходного обчаффиннои хроматографии используют з разца и полученных Фракций представ- частично очищенный препарат низко- лены на Фиг. 2. фракции предварительмолекулярного белкового антигена, по- но были объединены в два пула (соотлученный из экстракта Фасциол гель- ветственно пикам оптической плот- Фильтрацией на сефадекс Гности), сконцентрированы до объемов, (фракция с К= 0,3-0,4), Анало примерно равных объему исходного обгичный препарат можно получить на се- разца и охарактеризованы в реакции Фадекс Г, Г, Г, на сефа- иммунодиффузии с помощью иммунной розе 6 В или соответствующих гелях сыворотки кролика с экспериментальным других Фирм. Антиген переводят либо фасциолезом (4 мес. после заражения). посредством диалиэа, либо на колонке 4 Реакцию проводили в агаровом гелеЭ с сефадексом Гз рабочий буфер, используя штамп "семерка", в централь содержащий 0,5 М ИаС 1 (РН 3,8) . ную лунку которого помещали иммун 7 мп обработанного таким способом ную сывороткУ, а в периферические антигенного материала с титром антигены в раэчичных титрах (цифры 1:128 (по результатам иммунодиф-32 обозначают кратность разведеФузии) вносят в колонку, предва" , ния антигена). рительно заполненную .сорбентом иУ сор ентомэ и . Иммунологический анализ концен-. элюируют рабочим буфером несо биУФ Ро несорби- . трированных пулов, раститрованных . руемые гелем примеси п ис тств юР , рисутствую щелочным буфером, показал, что анщие в препарате (хромопротеид корич тигенная активность исходного образневого цвета, обуславливающий ца и пула 11 примерно одинакова. окраску препарата и экст акта Причем такая же иммунологическая геполипептидов и лр. .ля полного терогенность очищенного ан-нгена(2 полосы преципитации) свидетельствует о том, что в результатеаффинной хроматографии множественные Формы не теряются, а оказываются сосредоточенными вместе, тогдакак другие (неактивные) компонентыисходного образца удаляются в составе Фракций, соответствующих пику1. Последнее подтверждается следующими данными. Разделение антигенногопрепарата в результате аффинной хроматографии на две основные Фракции,соответствующие двум пикам на графике (фиг. 1), и сосредоточениеспецифической активности в однойиз них свидетельствует об удалениииз исходного препарата большогоколичества примесей (площадь первого пика, соответствующего неактивным примесям, больше площади пика 11,соответствующего активному материалу), При электрофоретическом анапизеисходного препарата антигена и полученных после аффинной хроматографии Фракций (пулов Т и 11) показано, что пул 11, обладающий антигенной и протеолитической активностью, гораздо менее гетерогенен,чем исходныйпрепарат, и что многиекомпоненты исходного препарата (хромопротеид, мигрирующий при электро.Форезе в виде одной, а иногда 2-3коричневых полос, до 5 полипептидов, идентифицированных по ихрастворимости в трихлоруксусной исульфосалициловой кислотах, инекоторые другие) попадают во Фракцию 1П р и м е р 2, Приготовление сор-бента для аффинной хроматографиипроводят так же, как в примере 1,но в качестве образца используютне частично очищенный препарат низкомолекулярного белкового антигена,а неочищенный экстракт Фасциол, содержащий, кроме антигена-протеинаэыдругие паразитарные антигены и массу самых различных примесей,Лля получения экстракта берут5 г Фасциол, добавляют 2,5 мл 0,2 Ицитат-Фосфатного (или другого) буфера с рН 3,9, гомогенизируют 5 минв блендере с режущими лопастями при0 - 4 С. Гомогенат центрифугируюто15 мин при 8000 обмин. Получаютоколо 5 мп экстракта с титром .антигена-,протеиназы 1:256. Хроматографическую колонку(1 см х 20 см) заполняют Я мл сорбента, приготовленного и обработанного таким же образом, как и в примере 1 и уравновешенную тем жебуфером с рН 3,9 (обязательно содержащим 0,5 М ИаС 1) и наносятна поверхность геля 4 мл экстракта.Антиген-протеиназа сорбируется вв геле и остается прочно с ним связанным, тогда как остальные компоненты экстракта, в том числеи высокомолекулярные белковые ннебелковые антигены вымываются припропускании через колонку 50 мл упомянутого буфера (Фиг, 3, пик 1).Элюцию сорбировавшегося антигенапротеиназы проводят с помощью щелочного буфера (0,05 М трис-НС 1/0,5 МИаС 1) с рН 8 (Фиг. 3, пик 11),Иммунологический и электрофоретический анализ Фракций, соответствующих пику 11, показал такую жестепень очистки антигена-протеиназыкак и в примере 1,Таким образом, этап предварительной очистки антигена протеиназы на сеФадексе не является обязательным итакая же эффективная очистка возможна непосредственно из экстрактаФасциол. П р и м е р 3. Более упрощенный вариант получения антигена состоит в том, что его очистку приводят не в колонке, а в объеме. Предварительную подготовку сорбента и образца проводят так же, как и в примере 1 и 2. Затем образец выливают в стакан с сорбентом и перемешивают 15 мин (нельзя использовать магнитную мешал ку, разрушающую сорбент). Полученную суспензию переносят на воронку со стеклянным Фильтром и промывают для удаления несорбируемых примесей, как обычно, кислым буфером с рН около 4. Промывают до тех пор, пока в Фильтрате не исчезнет белок (пока оптическая плотность Фильтрата при Фотометрировании не приблизится к нулю). Фильтрат отбрасывают, а к гелю на Фильтре добавляют щелочной буфер и вытекающий при этом Фильтрат, содержащий десорбировавшийся антиген-протеиназу, собирают в подходящую емкость.Такой способ не требует сложного оборудования но сопровождается несколько большим расходом буферов,1159579 Исхп 3 ный и антиген выходит более разбавленным, чем в колоночном варианте,П р и м е р 4. Подготовку образца, подлежащего хроматографии, его посадку на предварительно подготовленный сорбент при рН около 4 и удаление несорбируемого материала проводят так же, как и в примере 2 или 1. Однако сорбировавшийся на геле антиген-протеиназу элюируют не щелочным, а нейтральным буфером с рн 7.Заметной разницы в эффективности десорбции при этих условиях не наблюдается.Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить высокоочищен ный,препарат низкомолекулярного белкового антигена фасциол, причем не- :мотря на гетерогенность самого антигена, его множественные формы не теряются в процессе очистки,а оказываются сосредоточеннымивместе.Десорбция антигена при нейтральныхили слабощелочных значениях рНпозволяет не только сохранить егонативность, но и непосредственноиспользовать его для проведения иммунологических реакций, для которых 1 О такие условия являются наиболее оптимальными. Предлагаемый способ является более простым по сравнению с из - вестным, так как высокая степень очистки антигена может быть достигнута практически в один этап.Полученный антиген может быть использован в качестве диагностикума при фасциолозе сельскохозяйственных животных и человека,ио Составитель С. Вороор Л. Зайцева Техред Т.Маточка Корректор Е. Рошко е акаэ одписно омитета СССР открытий кая наб г. Ужгород, ул. Проектная ППП "Пате фил Т% 128 Она4750 ТиВНИИПИ Государстло делам изобр 113035, Москва, Жаж 722енноготений5, Рауш