Способ получения конъюгированных антигенов

(9) (и) 9 00,госуда стеенный комитет сссПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕтЕНИй И Отнрцтий ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ фф"ф ая(71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниямхимических соединений(56) 1. Коростелева Т.А., Потапенкова Л.С.Сравнительное изучениеканцерогенной активности и иммунологической специфичности аминоазосоединений. - "Гигиена труда и проФессиональные заболевания", 1978,В 5, с. 24-27.2. Полевая О.Ю., Башарова Л.АКовалев И.Е.Ковалентное связываниеэтаперазина с белком для получения антител, нейтрализующих физиологическое действие этаперазина, - "Химико-фармацевтический журнал", 1976, В 9,с. 15-19.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ, предусматривающий активацию бензидина и связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым .носителем при рН 7-8, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью улучщения иммунохимических свойств получаемого продукта, активацию бензидина осуществляют окислением его пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода при массовом соотношении реагентов (1-10):5:(0,6-2,4), а связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем проводят при весовом со отношении соответственно (6,6-17,4): :20.1 091 б 9 елок ЗНг ю связа 40 5 отонъю-. где- другие возможные места присоединения бензидина к белку.В результате таких превраЩений получают КА с повышенным качеством " 20 улучшенными иммунохимическими характеристиками, С помощью полученного предлагаемым способом конъюгированного антигена бензидин - белок выявляются антитела к бензидину у животных, ко торым вводили длительное время этот канцероген рег оз, выявляемый титр 1:512, что недоступно для КА, полученного известным диазометодом, Кроме того, при иммунизации животных 30 конъюгированными антигенами, полученными предлагаемым и известным способами, индуцируются антитела различной специфичности, Антитела, полученные с помощью предлагаемого способа, в незначительной степени перекрестно реагируют с вторым конъюгированным антигеном и наоборот.В предлагаемом способе получения КА бензидин - антигенный носитель реакционноспособное производное бензидина получают при добавлении к раствору бенэидина в диоксане раствора пероксидазы хрена и перекиси водорода в фосфатном буфере при рН 7-8 в указанном весовом соотношении при 20-25 фС, Смесь добавляют к 0,5 Х-ному раствору антигенного белкового носителя в фосфатном буфере при рН 7-8 в весовом отношении (б,б,4):20 со-оответственно при 0-25 С.по каплям при перемешивании, инкубируют. 10 мин, КА бензидин - белок очищают от низкомолекулярных продуктов реакциии пероксидаэы хрена колоночной гель-хроматогра фией на акрилексе П, Количество5 бензидина в КА определяют спектрофотометрически 1,2). В зависимости соотношения реагентов получают к гированные антигены бензидин - анти- генный носитель, в которых с одноймолекулой белка ковалент но 5- 40 молекул бензидина.В предлагаемом способе соотношение бензидина, белкового носителя и системы пероксидаза - перекись водорода, активирующей бензидин, выбрано в таких пределах, при которых образуется конъюгат оптимального качества, т.е. содержащий 5-40 молекул бензидина на одну молекулу антигенного носителя. При меньшей посадке гаптена на антигенный .носитель ухудшаются его антигенные свойства, при большем замещении возможны побочные явления при иммунизации животных, кроме того, ухудшается растворимость КА, Выбранный интервал температуры и величина рН оозволяет проводить реакцию ковалентного связывания бензидина с антигенным носителем с достаточно высокой скоростью при стабильности фермента и белкового антигенного .носителя.Иммунохимические исследования проводят на различных группах кроликов, иммунизированных КЛ, полученными диазометодом и предлагаемым способом, а также на,группе крыс, кормленных длительное время бензидином. Наличие антител к бензидину определяют в сыворотке крови иммунизированных и получавших гаптен рег оз животных стандартной РПГА и реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), используя эритроциты барана (ЭБ), сенсибилизированные соответствующими аитигенами. Максимальный титр антител к бенэидину у животных, иммунизированных КА бензидин - анти- генный носитель, полученнь 1 м предла11091 30 45 Фгаемым способом, составляет ф 512,а у животных, иммунизированных КА,полученным диазометодом - 1:256,Антитела, индуцируемые первым конъюгированным антигеном, дают слабыеперекрестные реакции со вторым КА инаоборот. Определяют низкий уровеньиммунного ответа (титр антител1:32) на бензидин в сыворотке крови крыс, длительно кормленныХ гаптеном, лишь с помощью конъюгированного антигена бензидин - белок,полученного предлагаемым способом.П р и м е р 1. Способ пдлученияКА бензидин-бычий сывороточный альб умин,К 10 мг (3,5,10 М) бензидинав 0,5 мл диоксана добавляют 5 мг(1,110 И) пероксидазы хрена в1 мл О, 1 М фосфатного буфера рН 7,4 20и 0,8 мл (6,4 -10 "5 М) О,ЗЖ-ногораствора перекиси водорода. Смесьперемешивают и по каплям добавляют к раствору бычьего сывороточного альбумина 20 мг в 2 мл 0,1 М 25фосфатного буфера рН 7,4. Реакционную массу инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.Полученный конъюгат бензидин-бычийсывороточный альбумин очищают ко"лоночной гель-хроматографией наакрилексе П. По данным спектрофотометрии с одной молекулой .белкав КА ковалентно связано 29 молекулбензидина.П р и м е р 2, Способ полученияКА бензндин-бычий сывороточный альбумин.К 1 мг (3,5 10 М) бензидинав 0,5 мл диоксана добавляют 5 мг(1,110 М) пероксидазы хрена в1 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4и 0,2 мл.(1,6 10 5 М) О,ЗЖ раствораперекиси водорода. Далее реакциюпроводят аналогично примеру 1.Получают КА, в котором с первоймолекулой белка ковалентно связано40 молекул бензидина.П р и м е р 3. Способ полученияКА бензидин-бычий сывороточный50альбумин.К раствору 5 мг (1,7 10 М) бензидина в 0,5 мл диоксана добавляютпероксидазу хрена и перекись водорода в соотношении, указанном в55примере 2, Далее реакцию проводятаналогично примеру 1. Получают КА,в котором на одну молеКулу белка приходится 15 молекул бензндина,П р и м е р 4. Антигенные свойства КА бензидин-бычий сывороточный альбумин. Кроликам весом 2 кг вводят внутрикожно в 10-15 разных точек 5 мг/кг веса животного конъюгированный 1 антиген, полученный по примеру 3, в смесис равным. объемом полного адъюванта Фрейнда. Аналогичную иммунизацию проводят через 7 дней. Через две недели дважды с интервалом в 7 сут животным вводят КА внутримьппечно в дозе 10 мг/кг без адъюванта. Спустя месяц проводят реиммунизацию четырьмя внутримышечными инъекциями КА 10 мг/кг с недельным интервалом, Через семь дней после последней иммунизации у животных берут кровь из краевой ушной вены и определяют титры антител к бензидину с помощью РПГА.Реакцию РПГА проводят на полистироловых пластинках, В каждую лунку пластин вносят по 0,025 мл среды рН 8,2. Затем в первую лунку каждого ряда добавляют по 0,025 мл иммунной сыворотки, предварительно декомплементированной при 56 О в течение 1 ч. Далее сыворотку расти" тровывают и добавляют в каждую лунку 0,025 мл 17-ной суспензии ЭБ, сен" сибилизированных КА бензидин-бычий сывороточный альбумин, полученным известным химическим или предлагаемым методом. Пластины инкубируют при 37 фС в течение двух часов. Оценку агглютинации проводят визуально по характеру осадка в лунках, Реакция считается положительной, когда наблюдают агглютинацию ЭБ при отсутствии агглютинации в контрольных лунках (без иммунной сыворотки)Сравнительные иммунохимические характеристики КА представлены в таблице 1. В прямых РПГА титр антител к КА бензидин-бычий сывороточный альбумин, полученному химическим диазоспособом, составляет -1 оя, = 21, синтезированному предлагаемым методом -1 оя, = 24. Низкий уровень иммунного ответа на длительное кормлениекрыс бензидином удается выявить лишь с помощью ЭБ, сенсибилизированных КА, полученным предлагаемым способом, титр антител составляет 1 оя, = 5.9 1109169 10Таким образом, при использовании личающихся лишь положением присоедипредлагаемого способа получения пения бензидина к белку. Иммуноконьюгированного антитела бенэидин- химические эксперименты показывают антигенный носитель по сравнению с различие антигенных детерминант срав" известным повышается качество ре ниваемых коньюгированных антигеагента для иммунохимическпх иссле- нов, причем с помощью КА, получендований. В известном диазометоде ного предлагаемым способом, опредеисходный гаптен модифицируют при ляют низкий уровень иммунного отковалентном связывании с белковым вета - наличие антител к бензидину в антигенным носителем. В предлага п сыворотке крови животных, длительно емом способе образуется смесь КА, от- получавших гаптен.Составитель О.Скородумова Редактор О.Бугир Техред О.Кеце Корректор В.Бутяга Заказ 5970/5 Тираж 688 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4