Способ определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАТЕНТУ(23) Приоритет - (32) 09,12.77 Союз Совет снихСоциалистическихРеспублик гиг 971120 Э(51) М, Кл,С 01 й 21/78 1 Ьеударотееииый комитет СССР ло делам изобретений и открытий(31) Р 2754944.6 (ЗЗЪ ФРГ Опубликовано 30,10,82 Бюллетень40 Дата опубликования описания 30,10.82(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ ИЛИ ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ 1Изобретение относится к способам ойределения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты.Определение аскорбиновой кислоты имеет большое значение, прежде всего в химии пищевых продуктов,.для оценки качества различных пищевых продуктов, таких, например, как фруктовые соки, свежие овощи, свежемороженные овощи и другие. Часто для прохладительных напитков требуется определенное содержанке витамина С, следовательно, оно должно контролироваться. Аскорбиновую кислоту добавляют в качестве антиокислителя и осветлителя, и поэтому содержание ее также должно определяться, При клиникодиагностических исследованиях обнаружение аскорбиновой кислоты в моче обеспечивает быструю диагностику различных заболеваний. Представляет интерес определение аскорбиновой кислоты в сыворотке для тропических стран, так как в условиях этих стран симптомы авитаминозов (цинги) настолько прикрываются симпто мами других болезней, что их невозможно выделить. Учитывая важность определения аскорбиновой кислоты, разрабснтаны различные способы ее определения.Все сказанное выше справедливо идля дегидроаскорбиновой кислоты, таккак аскорбиновая кислота под действиемкислорода воздуха легко переходит вдегидроаскорбиновую кислоту. Поэтомув испытуемых продуктах часто присутст вует смесь аскорбиновой и дегидроаскор. биновой кислот. Поскольку дегидроаскорбиновая кислота оказывает такое же действие, как витамин С, то в большинствеслучаев целесообразно определять содер жанне в испытуемом образце дегидроаскорбата.Известны различные способы определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновойкислоты, например хроматографический р) способ 1) .Время, необходимое для определенияпо данному способу, очень велико (неменее 2 ч), причем при подготовке пробы к хроматографии теряется значительное эь количество аскорбата и поэтому количестО, 1-15 3 971120 4венное определение с помощью указан- обрабатывают избытком гомоцистеинаного способа практически невозможно. при рН 7-8 и содержание дегидроаскорИзвестен также способ, основанный биновой кислоты определяют по разностина окислении аскорбиновой кислоты в между общим содержанием аскорбиновойдегидроаскорбиновую и осаждении послед и дегидроаскорбиновой кислот и содержаней в виде производного гидразина (2. нием аскорбиновой кислоты,Данный способ трудоемок и мало спе- Предлагаемый способ осуществляютцифичен, так как все соединения с кетон- в слабокислой среде. При таких значенияхными функциональными группами дают рН большинство мешанших веществ нетакую же реакцию, 10 вступает в реакцию или скорость ееНаиболее бпизок к предлагаемому спо- настолько замедляется, что практическисоб определения аскорбиновой или дегидро- ею можно пренебречь. В такой кислойаскорбиновой кислоты путем обработки среде скорость взаимодействия реактиваисследуемой пробы реагентом, содержащим с аскорбиновой кислотой мала, поэтомучетвертичную соль тетраэола и щелочно" 15 определение аскорбиновой кислоты с еебуферный раствор, с последующим изме- помощью практически невозможно. Однакорепием интенсивности окраски образую- добавление феназинметосульфата в комбинащегося окрашенного соединения 3.ции с детергентом ускоряет эту реакцию,Недостатком известного способа яв- Неожиданно то, что указанные добавкиляется то что его проводят в щелочной 20 не ускоряют реакцию реактива с мешающисреде и многочисленные вещества оказы- ми веществами.вают мешающее действие. Для установления рН, соответствующеКроме того, укаэанный способ дпите- го слабокислой среде, предпочтительнолен, в интервале между 4,0 и 6,0 (особенноцель изобретения - сокращение дт з между 4,8 и 5,3) могут использоватьсятельности определения и повышение спе- различные буферные системы, в частностицифичности, фосфатно-цитратный буфер, так как в этомПоставленная цель достигается тем, случае при всех количествах аскорбатачто берут две пробы, к первой пробе до- выполняется пропорциональность междубавляют реагент, содержащий фосфатно- ро экстинкцией образующегося окрашенногоцитратный буфер, полиэтиленгликолевый вещества и концентрацией аскорбата.эфир октилфенола, этилендиаминтетрауксус- Предпочтительным детергентом, исную кислоту, 3-(4,5-диметилтиазолил)- пользуемым в предлагаемом способе,-2,5-дифенилтетразолбромид, феназинмето- является полиэтиленгликолевый эфир октилсульфат и воду при следующем соотноше- фенола (тритон х 100),нии компонентов, вес. ; Скорость реакции увеличивает такжеФосфатно-цитратны й феназинметосульфат (ФМС), обеспечиваябуфер 0,5-20 количественное протекание реакции. ПриПолиэтиленглико- использовании других известных перенослевый эфир октил- чиков электронов такого ускоряющегофенола действия не наблюдается. КонцентрацияЭтилендиаминтетра- ФМС 0,01 - 1 ммоль/л (предпочтительуксусная кислота нее 0,05-0,15 ммоль/л), так как в этом(ЕДТА) 0,0045-0,045 случае не происходит взаимодействия3-(4,5-Диметил- реактива с соединениями, содержащимитиазолил) -2,5-ди Н-группы, такими как гомоцистеин.фенилтетразолбромид Такие соединения с 6 Н-группами можно(МТТ) О, 0003-0,03 добавлять, когда имеющийся в пробе деФеназинметосульфат 0,00025-0,0025 гидроаскорбат необходимо одновременноВода До 100 восстанавливать до аскорбата.а к другой параллельной пробе добавляют5 ОЕсли в исследуемой пробе находятсяукаэанный реагент, содержащий дополни- ионы двухвалентных металлов, склонныхтельно аскорбатоксидазу в количестве к образованию хелатов, то могут обра 0,0001-0,005 вес.%, вычитают экстинк- зовываться хелаты в результате взаимоцшо параллельной пробы из экстинкции действия с получающимся окрашенным55первой пробы и рассчитывают содержание соединением формазина, что может влиятьаскорбиновой кислоты, причем в случае на результаты измерений. Хотя образоваопределения дегидроаскорбиновой кислоты ние хелатов в значительной степени попервую исследуемую пробу предвари 1 ельно давляется вследствие применения цограт5 9711но-фосфатного буфера, однако целесообразно добавлять дополнительно к пробе небольшие количества комплексообразователей, таких как этилендиаминтетрауксусная кислота с концентрацией 0,00450,045 вес.%. В особых случаях, в частности при анализе проб с очень высокимсодержанием ионов двухвалентных металлов, целесообразны и добавки вбольшихколичествах. 10При осуществлении предлагаемогоспособа используют параллельную пробу,дополнительно содержащую аскорбатоксидазу, которая избирательно окисляет содержащийся в параллельной пробе аскорбат. 15По окончании реакции окисления параллельную пробу используют как холостую пробу,для определения количества аскорбиновойкислоты, т.е. экстинкцию холостой пробывычитают из экстинкции исследуемогс 20раствора и разность используют для расчета количества аскорбиновой кислоты,Данный вариант осуществления способаповышает его специфичность, в особенности в тех случаях, когда в исследуемом 25растворе присутствуют вещества, которыемогут взаимодействовать с солью тетразола.При определении дегидроаскорбиновойкислоты ее переводят в аскорбиновую 3 Окислоту и определяют описанным способом,восстанавливают при помощи органического сульфгидрильного соединения, предпочтительно гомоцистеина, который беретсяв избытке, в нейтральной или слабошелочной среде, при рН 7-8(при использованиигомоцистеина - при рН 7,5. Если затемдля определения образующейся аскорбиновой кислоты устанавливают значение рН,соответствующее слабокислой среде, товзаимодействие реактива. с аскорбиновойкислотой протекает без всяких осложнений,т.е. избыток сульфгидрильного соединенияне восстанавливает вновь образующуюсяв ходе реакции дегидроаскорбиновую кислоту, и, таким образом, не происходитискажения результатов анализа,Способ позволяет определять дегидроаскорбиновую кислоту в присутствии аскорбиновой кислоты. Для этого вначалеопределяют в пробе содержание аскорбиЯновой кислоты, а затем во второй пробевосстанавливают дегидроаскорбиновуюкислоту и определяют ее. По разностиполученных результатов можно определитьколичество в пробе дегидроаскорбиновой55кислоты.Реакция согласно предлагаемому способу протекает примерно 30 м:н,20 6Измеряют интенсивность окраски образующегося окрашенного соединения, например, обычным фотокопориметром при подходящей длине волны, например при 578 нм. Однако для определения интенсивности окраски можно использовать и другие известные методы. Удовлетворительные результаты дает и оценка по сравнению полученной окраски с эталонной, в особенности, когда предлагаемый способ проводится с использованиеМ индикаторных полос.А, Определение аскорбиновой кислоты,Готовят раствор следующего состава; г/л (%); МсНРО 4 36 (3,6) Лимонная кислота 20 (2 ) Тритон Х15 (1,5) ЕДТА 0,45 (0,045) МТТ 0,041(0,0041) В две кюветы (одна из них содержит пробу, вторая - холостую пробу)заливают по 3,00 мл раствора и 0,1 мл исследуемой пробы. Пробу и холостую пробу нагревают до 37 ОС. К холостой пробе добавляют 0,00033% аскорбатоксидазы (0,01 мг/Змл) и инкубируют 2 мин. При этом аскорбиновая кислота разлагается. Затем к обеим пробам добавляют по 0,075 мг ФМС так, чтобы содержание раствора в них составляло 0,0025%.Снова инкубируют 5 мин. После этого определяют экстинкцию холостой пробы (Е ) и пробы (Е ). Рассчитывакт ьЕ по формуле ЬЕ=ЕР Е 1.Содержание аскорбиновой кислоты в пробе рассчитывают исходя из общей расчетной формулы для определения кон- центраций где Ч - испытуемый объем, млч - объем пробы, млМ 5 - мопекулярный вес определяемоговещества;б -толщина слоя, см;в - коэффициент экстинкции МТТ-формазона (при 578 нм б 16,9),лммоль "см,.".Отсюда для , -аскорбиновой кислоты 1,70 176,1 Ъ С-ВЕ 16,9. 1 0,10,100Приготовление растворов: , 1% а) буферный раствор (фосфатный буфеР, 0,1 ммоль/л, рН 7,5) 163 мг КН РО и 2,00 г КРО, 3 Н 10 растворяют примерно в 70 Мл воды и доливают до 100 мл,б) раствор гомоцистеина. 60 мг гомоО цистеина растворяют в буферном растворе (а) и доливают до 50 мл, .в) раствор ттробы с аскорбиновой кислотой + ДГА (не больше 0,6 г/л).Значение рН пробы доводят до 7,5 и раствором едкого калия (2 моль/л) .,: и разбавляют водой до пригодной концентрации. В пробирку вносят пипеткой по 50 мп растворов (а), (б) и (в), смешивают их и оставляют на 15 мин при комнатной; температуре. О, 1 мл инкубированного раствора исследуют на содержание аскор, биновой кислоты согласно А,35Расчет.1. Общее количество аскорбиновой кислоты (ДГА + аскорбиновая кислота) с р С аЕ,пробы а чча ООООгде Рфактор разбавления пробы;инкубационный объем, мл;испытуемый объем, мл;объем раствора пробы (в) приинкубировании, мл;объем инкубированного растворав тесте, мл;молекулярный вес аскорбиновой50кислотытолщина слоя, см,коэффициент экстинкции МТТформазона (при 578 нм1 619) у л ммолт, смО т.е,1,5 2.,7 П 6,13р 8+.рр16,9 0,5 0,1 4 100 7 9711Если предварительно пробу разбавляют,то результат умножают на фактор разбавления Р,Б. Определение дегидроаскорбиновойкислоты (ДГА). 5Восстанавливают ДГА до аскорбиновойкислоты в присутствии гомоцистеина (прирН 7,5). Определяют сумму аскорбиновойкислоты и ДГА и рассчитывают в видеобщего содержания аскорбиновой кислоты. 10После вычета определенной в отдельномтесте аскорбиновой кислоты из разницыможно рассчитать количество ДГА. 20 82, Аскорбиновая кислота из расчетапробы (г/л щюбы).3. Дегидроаскорбиновая кислота.Сга = (результат из(1)- результат из(2 0,9886 (г ДГА/л пробы)МС, 174, 13176, 13М ыскорбИсследуют сок черной смородины на ;одержание в нем аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислоты.0,1 мл сока исследуют согласно А на содержание аскорбиновой кислоты, при этом ь Е равно 0,43,что соответствует содержанию 0,121 г/л или 0,0121%.Для ойределения содержания в немдегидроаскорбиновой кислоты 0,5 мл сокаобрабатывают согласно Б гомоцистеином.0,1 мл полученного при этом инкубированного раствора исследуют согласно А насумму аскорбата и дегидроаскорбата.Е при этом равно 0,38. Отсюда по указанной в Б формуле рассчитывают суммуаскорбата и дегидроаскорбата, равную0,329 г/л или 0,0329%. Содержаниедегидроаскорбата составляет 0,329-0, 121==0,208 г/л или 0,0208%.Проведена серия опытов определенияаскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты,П р и м е р 1. Фосфатноцитратныйбуфер, поверхностно-активное вещество,комплексообразователь, соль тетразола,ФМС, а также воду и исследуемую пробувводят в кювету обычного фотокалориметра.После осуществления, реакции измеряютразность экстинкции по сравнению с воздухом или водой. В параллельную холостуюпробу вводят, кроме того, аскорбатоксидазу (ААО). Такое же количество ААОвводят в исследуемую пробу после окончания реакции, чтобы скомпенсировать разницу в экстинкции, обусловленную самойААО,Подробности проведения способа, применяемые реактивы и их количестваприведены в табл, 1.Реактивом приведенного выше состава можно определять от 5 до 250 мг аскорбата в исследуемой жидкости, При более высоких концентрациях пробу необхотомо соответствующим образом разбавить, при меньших концентрациях брать большее количество пробы. Количество воды при этом соответствующим образом должно быть уменьшено.9 9711 При проведении всех последующих определений используют составы реагентов аналогично примеру 1 (табл. 2).П р и м е р 2. Определение аскорбата в апельсиновом соке. В0,1 мл апельсинового сока вводят в кювету в качестве пробы аналогично примеру 1, В результате обнаруживают концентрацию витамина С 305 мг/л, что соответствует декларации (300 мг/л), 10 После анализа количество аскорбиновой кислоты, введенной в пробу, полностью определяется (100%). Окраска с течением времени не изменяется. Небольшое помут,нение апельсинового сока не оказывает 1 влияния нв результаты анализа.П р и м е р 3. 2,0 лимонного напитка растворяют в 20 мл воды и 0,1 мл полученного раствора вводят в кквету по примеру 1. Находят 96 мг витамина 26 С на 100 г сухого вещества. Изменения окраски с течением времени не наблюдается. Определяют 99,2% аскорбиновой кислоты, добавленной в пробу перед разбавлением. Небольшое помутнение раст вора не оказывает влияния на результаты анализа.П р и м е р 4. Определение аскорбата в плодах шиповника.5 мл концентрата шиповника раство- ЗО ряют в 100 мл воды. 0,1 мл полученного раствора после центрифугирования вводят в кювету по 1 тримеру 1. Находят 1770 мг витамина С в расчете на 1 л концентрата. Н ебольшое изменение окраскиЗ во времени, наблюдавшееся в пробе и в холостой пробе, учитывают с помощью экстраполяции, Аскорбиновой кислоты, добавленной к пробе перед разбввлением, обнаруживают 100%. Легкое окрвшивание,щ разбавленного экстракта не оказывает влияния на результаты анализа.П р и м е р 5. Определение аскорбата в соке черной смородины.1 мл сока черной смородины разбавля- ют водой до 10 мл и 0,1 мл полученного раствора вводят в кювету по примеру 1. Находят 305 мг/л витамина С. Обнаруживают 100% аскорбиновой кислоты, добавленной перед разбавлением. Изменения окраски с течением времени не наблюдается Чтобы проверить, не оказывает ли мешающего влияния неразбавленный сильно окрашенный сок, для снижения в . нем содержания аскорбвта его выдерживают в открытой посуде в течение 4 недель в холодильнике. Затем 0,1 мл неразбавленного сока вводят в кювету, Находят еше 93 мг/л витамина С. Интенсив 20 10ная окраска исходной пробы не оказываетмешающего влияния. Изменения окраскис течением времени не наблюдается.Добавленная в пробу аскорбиновая кислота полностью определяется.П р и м е р 6. Определение аскорбатав пиве,Чтобы обеспечичь прозрачность ивозможность консервирования в пиво мож-но добавить аскорбиновую кислоту, хотядля баварского пивоварения эта операцияне приемлема. Ни в светлом или темномбочковом пиве, ни в пиве в банках припроведении анализа по способу, описанному в примере 1, аскорбиновой кислотынет. Мешающего влияния не обнаруживают,Добавленное в пробу количество аскорбиновой кислоты полностью обнаруживают.П р и м е р 7. Определение аскорбатав шпинате.Бланшированный свежемороженны йшпинат поспе оттаивания тщательно перемешивают, 50.г его обрабатывают известным способом, но вместо НРОэиспользуютметафосфорную кислоту. Вводят 0,2 мл, экстракта, рН которого равен 5. Припроведении способа аналогично примеру1 находят 22 мг аскорбата в расчетенв 100 г свежемороженного шпинатапри содержании в нем 8% сухой массы.Это соответствует 275 мг аскорбатв врасчете на 100 г сухой массы, Из добавленного к шпинату перед экстрагированием количества аскорбиновой кислотыобнаруживают 99,8%. Изменения окраскис течением времени не наблюдают.П р и м е р 8. Определение аскорбатав картофеле.50 г картофеля моют, измельчают иобрабатывают таким же образом, как ишпинат в примере 7. рН.экстракта устанавливают равным 5 и объем его доводятдо 100 мп. После центрифугирования500 мл вводят в кювету. Обнаруживают18,9 мг аскорбата в расчете на 1 кгкартофеля. Обычно эта величина составляет примерно 150 мг/кг. В данном случае используют старый картофель, сильновысохший и частично проросший, В этих .условиях содержание витамина С в немсильно снижается или даже полностьюисчезает. Для проверки к картофелю передэкстрвгироввнием добавляют 75 мг аскорбиновой кислоты, после чего определяютее в количестве 97%.Изменения окраски с течением времени не найподвют.П р и м е р 9. Определение аскорбатав сыворотке.2 971120 П р и м е р 12, Определение дегидроаскорбиновой кислоты.Исследуемый материал экстрагируюти в случае необходимости разбавляют так,чтобы содержание дегидроаскорбата составляло 75-1500 мг/л (0,005-0,10%).Для раствора устанавливают показательрН, равный 7,5. К двум частям этогораствора добавляют две части К-фосфатного буфера (рН 7,5, 0,1 ммоль/л, 1%,диапазон 0,1-2%). 0,1 мл приготовленного таким образом раствора исследуютчерез 15 мин аналогично примеру 1 нааскорбат и определяют сумму аскорбатаи дегидроаскорбата. Принимая коэффициентразбавления Г равным 2,5, можно определить после вычитания полученного ранеесодержания аскорбата содержание в пробедегидроаскорбата,Спустя 2 ч после введения О, 5 г аскорбиновой кислоты у человека берут на анализ мочу, которую делят на 3 порции: первую (1) используют неизменной, вторую (2) дополняют 0,005% гомоцистеина и третью (3) - 0,01% дегидроаскорбиновой кислоты. Исследуют их по описанному в А способу на содержание аскорбиновой кислоты (способ 1), Для сравнения используют известные способы: окисление аскорбиновой кислоты и осаждение в виде производного гидразина (способ 11) и восстановление дихлорфенолиндофенолом (реактив Тиллманна) в качестве титриметрического метода (способ П 1).Результаты представлены в табл, 3. В каждой порции должно быть одинаковое количество аскорбиновой кислоты, и только предлагаемый способ (способ 1) дает одинаковые значения. Способ 11 частично выявляет добавленную дегидроаскорбиновую кислоту (отклонение в порциях 1 и 2 вызвано неточностью способа). Способ Ш зачастую дает сильное искажение вследствие введения гомоцистеина, который включается в качестве восстановитетакже вызывает значительное увеличениезначения. Предлагаемый способ определения аскорбиновой кислоты (витамина С) и дегидроаскорбиновой кислоты прост и по сравнению с известными способами значительно более специфичен, более устойчив к мешающему влиянию других веществ и менее длителен. 11Содержание аскорбиновой кислоты всыворотке должно находиться в пределахмежду 2 и 15 мг/л на 1 мл сыворотки,из которой с помощью трихлоруксуснойкислоты удаляют белок и используют в 5качестве пробы. В шести различных сыворотках обнаруживают от 1,5 до 2,64 мг/ласкорбата. Изменения окраски с течениемвремени не наблюдают. При добавке впробу 17,2 мг аскорбата на 1 л сыворот ки вновь обнаруживают практически 100%.П р и м е р 10. Определение аскорбата в моче.Содержание аскорбата в моче можетдостигать значительных количеств. При 1 Знормальном питании в мочу попадает от10 до 100 мг/л. При приеме доз, больше 100 мг 60-80/О принятого количестваобнаруживают в моче. Поэтому при потреблении аскорбиновой кислоты в количест 20вах, во много раз превышающих нормальное, следует ожидать и большее, чем100 мг/л, содержание ее в моче, В свежей моче при объеме пробы 0,1 мл обнаруживают 257 мг/л аскорбата. При этомвновь обнаруживают 98,3% добавленнойперед анализом аскорбиновой кислоты.Изменения окраски с течением времении других мешаюших влияний не наблюдают.П р и м е р 11. Большие количества 30витамина С в моче, найденные в примере 10, могут частично или полностьюподавлять образование окрашенных соединений на обычных индикаторных полоскахна глюкозу, кровь или билирубин и т.д.,основанное на окислении различных лейкоокрашенных соединений, и, таким бобразом, приводить к искажению результатов,что может быть установлено с помсвцьюиндикаторной бумаги. Круглый фильтр из 40испытуемой бумаги. тщательно промываютраствором 0,2 молИ Ма 8 Р 04 /О, 1 моль/ллимоннокислого буфера с рН 5, отсасываютна вакуумном фильтре и сушат в вакуумепри комнатной температуре. Затем нафильтр, лежащий в чашке Петри, наливаютсмесь, соответствующую по составу холостой пробе примера 1, но не содержащуюпробы и аскорбатоксидазы, после чего ля. Однако дегидроаскорбиновая кислотаего снова сушат в вакууме при комнатнойтемпературе в темноте. На подготовленныйтаким образом фильтр наносят по каплерастворы, содержащие 2; 5;10 25 и 50 мгаскорбата/100 мл. В течение 1 мин набумаге образуются сине-фиолетовые пят 5 эна, интенсивность окраски которых возрастает с увеличением концентрации аскорбата. При накапываний воды наблюдаюттолько легкое желтое окрашивание.,4 971120 Таблица 1 Исходный раствори ход опыта Проба,Концентрацияпри испытании Холостая проба И 1 НРО+ ндию 4 3 6%Лимонная кислота 2% 1,5 1,5 Лимонная кислота4%рН 5 Тритон Х 100 1,5% Тритон Х 100+ 3%ЕДТА 0,09% ЕДТА 0,045% 1,0 1,0 Вода 0,1 0,1 Проба ААО" 0,05% Испытуемый раствор0,000333% О, 02 МТТ 0,062%ФМС 0,0375% 0,2 0,2 0,2 0,2 ААО О, 05% 0,02 Ф После введения ААО инкубируют 2 мин. После введения ФМС инкубируют до прекрашения реакции (около 30 мин). Таблица 2 Фосфатно-цитратны Йбуфер 2,4 0,5 20 1,0 Тритон Х 100 ЕДТА Аскорбатоксидаза МТТ О, 00025 0,0005 до 100 до 100 ФМС Вода 0,010,0050,03 О, 0045 0,0001 0,0003 0,176-8,8 мг/л аскорбата (0,0000176-О, 00088% О, 00414%0,025%0,000333% О, 045 0,002 0,009 0,0025 до 100Заказ 8459/81 Тираж 887 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5Филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения Способ определения аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты с использо ванием обработки исследуемой пробы реагентом, содержащим четвертичную соль тетразолия и буферный раствор, с после-дующим измерением интенсивности окраски образующегося окрашенного соединения, о т л и ч а ю ш и й с я тем, что, с целью сокрашения длительности определения и повышения специфичности, берут две пробы, к первой пробе добавляют реагент, содержащий фосфатно-цитратный ЗО буфер, полиэтиленгликолевый эфир октилфенола, этилендиаминтетрауксусную кислоту 3-(4,5-диметилтиазолил)-2,5-дифенилтетразолбромид, феназинметосульфат и воду при следующем соотношении ком- З 5 понентов, вес.%:фосфатно-цитратныйбуфер 0,5-20Полиэтиленгликолевы йэфир октилфенола 0,1-1,5 40Этилендиаминтетрауксусная кислота 0,0045-0, 0453-(4,5-диметилтиазолил) -2,5-дифенилтетразолбромид 0,0003-0,03 феназинметосульфат 0,00025-0,0025 Вода До 100и к другой параллельной пробе добавляют указанный реагент, содержащий дополнительно аскорбатоксидазу в количестве 0,0001- О, 005 вес.%, вычитают экстинкцию параллельной пробы из экстинкции первой пробы и рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты, причем в случае определения дегидроаскорбиновой кислоты первую исследуемую пробу предварительно обрабатывают избытком гомоцистеина при рН 7-8 и содержание дегидроаскорбиновой кислоты определяют по разности между общим содержанием аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот и содержанием аскорбиновой кислоты. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Эсаогп оЕЕег ЭЕг,З. НаМЬосб бег ЬеЬепее 1 се 1 сает 1 е. Ьа,М,2 . 5 рг 1 осег- Чег 8 бсс", бега,1 н -- Не 1 де 0 Ьег, Й 61, 5, 64-765.2. Там же, с. 765-769.3. Там же, с. 765-789 (прототип).