Способ получения вакцины

ОП ИСАЙИ ВИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТИНТУ(3 ) 7704348 (33) НидерландыОпубликовано 30.10.82, Бюллетень М 40 Сфвз СаеетсиииСфцтеалмстичвсим кРеспубими й 971108(088.8) ев делам вэееретенкй и еткрмтийДата опубликования описания 30,1.0.82 Иностранцы Петер Альберт Бахманн и Антон Майер(72) Авторы изобретения Иностранная фирма(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ Изобретение относится к способу попучения вакцины, которая может быть испопьзоввна дпя зашиты поросят от трансмиссивного гастроэнтерита.Известен способ попучения вакцины дпя зашиты поросят от трансмиссивного гвстроэнтерита путем многократного пересеивания исходного вируса на купьтуру клеток почки собаки с интервапом в 24 ч ипи меньше и сбора вирусосодержа- ц щего материала 1.Однако известный способ недостаточно эффективен, поскольку он приводит к ограниченной защите поросят от инфекционного забопевания.15Цепь изобретения - повышение эффективности способа.Поставленная цепь достигается путем 250-300 пересевов исходного вируса на культуре клеток щитовидной жепезы свиней через 1-2 дня.при 37 С и сбора вирусосодержашего мвтериа па.Было установпено, что еспи вакцину,. попученную в соответствии с предпагаемым способом, вводят свиноматкам орапь 2но, то оспабпецный вирус продопжвет размножаться вдопь всего кишечного трактаживотного, Поросята, родившиеся от таких свиноматок, явпяются попностью защищенными от воздействия инфекции, вызываемой виру пентным вирусом трансмисснвного гастроэнтеритв (ТГЕ) с помощьюантитеп ИгА (иммуногпобупина - А), содержащихся в мопозиве.В табп; 1 приведены значения титровантитеп ИгА проб мопоэива, опредепенные в ходе проведения испытаний с нейтра пизацией сыворотки,Упомянутые пробы центрифугируют,раэбавпяют физиопогическим растворомМаС (1;10) н нагревают до 40 С в течение 30 мин, Затем доводят значениерН раствора до 4,6-4,65 с помощью смеси равных объемов 1 н, НС 1 и 2 М уксусной киспоты, после чего перемешивают попученный раствор в течение 20 мин, Поспе центрифугирования (12,000 с и 4 С)осушествпяют в течение ночи диапиэ относитепьно 0,1 М трис-гндроксиметипаминометана, 0,2 МсаСВ, рН которого до3 ,97 водили до 8,0 с помощью 1 н НСР, Пробы после этого концентрируют до половины объема в 5% Сагбоела(молекулярный вес 20,000) и вводят в колонку (2,5 к х 100 см) с 5 ерйадехС. Вымйвание осуществляют с помощью трис-ИаС 6- буфера, рН 8,0.Таблица 1 Титр антител ИгА1:50 0.:31;25 1108 4ре и вновь центрифугировапи, Клеточный осадок помещали в 10 мп купьтурапьной среды. В качестве купьтурапьной среды ,испопьзовапи раствор сопи Ем гете. Однако можно использовать также и другие подходящие купьтурапьные среды, Среда дпя выращивания содержала 10% сывороткителенка и 5% поддерживающей среды, Кроме того, среда содержала 50 мп гидропизата пактапьбумина на питр среды, и, возможно, один ипи несколько антибиотиков, Рост клеток происходип в обычных сосудах дпя выращивания купьтур, например в плоских стеклянных или пласт тиковых сосудах. Купьтурапьную средузаменяют после 2-3 дней. После выдер-.живания купьтуры при 37 С в течение 4-6 дней первичные клеточные купьтуры обычно закрывались споем клеток,:2,5 35 55 Поспе введения свиноматкам вируса ТГЕ поспе 300-го пересева, оспабпенного в соответствии с изобретеним, вмолозиве обнаружено сравнитепьно высокое содержание антител ИгА.П р и м е р 1. Исходный вирупентный вирус выделяют из зараженной свиноматки в "3 пМ 1+ц 1 Ог М 1 о.оЫо 0 ое опт ЪУесОовМапМЪеМед бег 11 егев Мюнхене. Эту исключительноболезнетворную вирусную цепочку (далееБ 1-цепочка) выделяли непосредственнона живой ткани щитовидной железы свиньиаКлеточные культуры живой ткани щитовидной железы свиньи получали, используя шитовидные жепезы, попученные со скотобойни Мюнхена, Шитовидные жепезыпосле удаления их из упаковки и стерилизации поверхности, осушествпяемой дважды 95% спиртом, разрезали на кусочкиразмерами 1-2 мм и промывапи их трираза фосфатным буфером (СРБФ). К кусочкам живой ткани добавпяпи 0,37%трипсин-буферного раствора (не содержащего Са и М ), поспе чего осушестЦвпяпи фракционную обработку трипсиномлри температуре 37 С. Первые две фракции трипсина сливали (поспе обработкив течение 1 ч), а фракции 3 и 4 (времяобработки 15 ч) отфипьтровывапи и хранипи при температуре 4 оС. По окончанииэтой обработки суспензию клеточноготрипсина центрифугировапи в течение10 мин (500 г). Всппываюшую на поверхность жидкость спивачи, а осадоксуспензировапи в СРБФ фосфатном буфе 25 30 40 45 50 Вторичные клеточные купьтуры, полученные из шитовидных жепез свиньи, испопьзовапи дпя прохождения через них В 1-цепочек вируса ТГЕ в вышеупомянутых клетках и для опредепения инфекционной способности вируса в различных частях тонкой кишки. Упомянутые вторичные клеточные культуры попучапи вновь путем высевания первичных клеточных культур при соотношении 1;2.Оспабпение вируса осушествпяпи в результате 250-350 поспедоватепьных цересевов на вторичных кпетках живых тканей щитовидной железы свиней при 37 С. Упомянутые поспедоватепьно переосевы осушествпяпи обычным образом. На основе патогенного эффекта и с помощью титрований вируса установипи, что титр вируса обычно бып максимапьным поспе инкубации в течение 24 28 ч.П р и м е р 2. )1 пя того, чтобы опредепить впияние поспедоватепьных пере- севов на мягкой ткани щитовидной жепезы свиней на вирупентность вируса, каждый раз вводипи двум разным поросятам из одного приплода свиноматки 2 мп вирусосодержашего материала поспе 2-го (2 х 10 4 ЭЗГ/мп), 120-го (2 х 10 ЭЗГ/мл), 250-го (8 х 10) ЭЗГ/мп)-, 300-го (4 х 10 ф ЭЗГ/мп) и 350-го (4 10 ЭЗГ/мл) пересевовТитры выра -6жены в единицах образования зоны гемолиза на мп (ЕЗГ/мл). В возрасте 1-2 дня экспериментальных животных отнимали от свиноматки, которые обпадапи нейтрапизуюшими антитепами, обеспечивавшими иммунитет против вируса ТГЕ, и поили из бутылки, На второй день жизни поросят заражали орально путем введения им 2 мп одного из вышеупомянутых ви5 971108 6русов, содержащего материап, попученйЮ пе разпичного количества пересевов, такопри разпичном чиспе цересевов, десяти го же как и в примере 2 и по той же саконтропьным поросятам давапи 2 мп кунь-: мой методике. Сразу же поспе того, кактур пьно среды. отмечапись первые симптомы типичногоХод течения клинического забопевания у заряжения вирусом ТГЕ, поросята, котсвконтропировапи два раза в день. Когда рых держали изопированно друг от другапоросята оставапись живыми на десятый и заражапи каждого по отдельности, быдень, у них брани пробу крови дпя опрепи Убиты. Начиная от двенадцатиперснойдепения содержания антитеп. Копичество кишки, брались пробы общим количествомантитеп оцредепяпи с помощью теста, ос й 10 штук тонкой кишки, снятые на равнованного на нейтрапиэации сыворотки, ных расстояниях 25-35 см. Эти пробыс испопьзованием способа попучения мик- использовали дпА того, чтобы опредепитьротитров (ФИе К;И,ДгсЭ.сея Ч 1 гияЕогЬсЪ титр вируса, распространенного на раз 1 97 1, 33, Я. 17 1-17 6). личных участках тонкой кишки, Титр оцПервое появление поноса рассматрива Редепяли поспе гомогенизации образца влось как конец инкубационного периода. стУпке и центрифугирования 10% суспенРвота набпюдалась только у тех поросят, зии в СРБф. Иэ всппывающей жидкостикоторым вводипи вирус поспе второго не- готовили десятикратно раэбавпенные проресева. Дпя этого пересева инкубацион- бы, из которых каждый раз быпи инкубиный период составлял 16-18 ч. При боль-щ Рованы 0,2 мп отдепьных проб - 4 трубшем копичестве пересевов происходипо ки, содержащие кпетчатую купьтуру шиувепичение инкубационного периода, кото- товидной жепезы свиньи; Поспе инкубациирый достигап для 300-го пересева 80 ч, . 4 течение.7 дней при 37 оС отмечапсяПосле заряжения вирусами, выдержавцитопатогенный эффект ШПЭ) и проводящими 2-й, 120-й и 250-й пересев, у 2 й пи опредепение. титра в соответствии споросят появпяпся понос, который продоп- методикой Кербера (йапоп-БсЪт 1 едежапся в течение нескопьких дней. Поро-: фе"Ю гс хР РсоФщгпрсо 1,162),сята, которые попучипи вирус после 300 1931 4. 480-482)го пересева отличались твердыми экскрементами в течение нескольких дней,в Зй Как следует из Результатов представто время как у поросят, попучивших ви- пенных в вышеприведенной табпице вифурус после 350-го пересева, вообще не нентный вирус, попученный поспе второгоотмечацось никаких симптомов бопеэни, пересева, размножается во всей тонкойПоросята, которых эаражапи вирусом кишке, но не распространяется в ней, Топоспе второго пересева, умерпи через 1-.з же самое относится к вирусам, получен 2 дня спустя поспе введения вируса. Ни ным поспе 120-го н 250-го пересевов.один из шести поросят, которым вводипи ,Опя случая 2-го пересева титры вирусавирус поспе 120-го пересева, не остап- находятся между 0,5 и 1,0 Гол;10 ТС 3ся в живых. Из четырех поросят, которым 50/0,2 мп в то время, как титры дпявводипи вирус поспе 250-го пересева, 4 й вируса поспе 120-го пересева находятсяуцепеп топько один. Все животные, за- в предепах от 2,0 и 4,5 0 о ТС Ораженные вирусом, попученным поспе 50/0,2 мп. Подобные же значения тит 250-го пересева, выздоровели поспе бо- ров были получены дпя вирусов поспепезни, так же как и поросята, которым250-го и 300-го пересевов, В противовводипи вирус поспе.250 пересевов. 4 попожность этому можно показать, чтоИз этих результатов можно сдепать размножение вируса, попученного в ревывод, что вирупентность вппоть до 250- зупьтате 350 пересевов происходит топьго пересева была только спегка оспабпе- ко центральной части тонкой кишки,на, так что бопезнь, вызванная инфекцн- П р и м е р, 4. Опыты провоаипи се, оказывапась весьма серьезной, пос свиньями-самками. В начале опытайпе чего наступила смерть. все свиньи не содержапи антитеп ТГЕ-виП р и м е р 3, Этот эксперимент руса. У группы 1 состоящей из 8 свиосуществпяпи с той цепью чтобы опре- ньей-самок, иммунитет создавапи путемдепить, где происходит размножение ви- двукратного орапьного введения вирусноруса, полученного поспе разпичного копи- го материапа прибпиэитепьно за 5 и заЯчества пересевов вируса, оспабненного в 2 недели до ожидаемого опороса. Иммунисоответствии с изобретением, в тонкой, тет наступал при орапьном введении 4 мпкишке. С этой цепью осушествпяпн введе-.;вирусного материала в киспотостойкой капние новорожденным поросятам вируса пос-, супе,( 1 2 256 2 А 64 64 128 6-256 87 7 971108 8Группа(4 свиньи-самки) получала бып применен дпя заражения поросят всех половину вирусной дозы орально (2 мп) 13 самок на третий день после рождения. в капсуле и поповину - через нос. Вирус-,Впя этой цепи 1 мп суспенэии бып разный материал бып безвреден дпя свиней. бавпен таким образом, чтобЫ он содерОдна свинья быпа контропьной и не % жап 100-1000 Р 1 Р (заразной дозы дпя получала вируса. свиней), и эту дозу вводили каждому поВ качестве вирупентного опытного ви- росенку.руса бып взят штамм Миппера ТГЕ-виру. са. После трех пересевов через, поросят Титр нейтрализации сыворотки свинобыпа приготовпена 10% суспензия тонко 10 матки и поросят после пассивной иммунипротертой тонкой кишки в РВ 5 . Поспе зации вирусом, ТГЕВ 1-цепочки полученцентрифугирования, разделения на порции ной после 300-го пересева, и копичестпо 2 мп и замораживания при температу- во живых поросят через 15 дней поспе ре -70 оД указанный вирусный материал рождения приведены в табп. 2. И ъ Г/3 ко Пр ечание,Т ает попную нейтрвпн сывороткой; А - сы- сыворотка порося озна ю не рвзбавпениньи-самки кв сви рупентного вирусапоросят иэ 63 (то1 остались в,живых.3 После действия в штамма Милпера 55 есть 87%) в группе иэобря мкциоси вного тного перкультурематерна натем, что,ости способиспользуюжепезы00 пересев В г24. Нгрупденни. 23 поросенка изз контрольнойдней поспе рож6 порося пи через рупп о вспы ум В этом эксперименте вн ный поспе 300-го пересе ды орапьно в копичестве 5 был заключен в капсулы у воздействию желудочных ки росята, участвующие в это твпись живы. рус, попучен вв, вводипи дввжмп, причем он стойчивые к слот. Все пом опыте, осинформации,ание прн экспертизеЖ 3479430,пик. 1969 (прототип Составитель Т. ШмепеваЗакв и пи А 128 256 12 Форму паСпособ получени.поросят от трансмита путем многокраходного вируса навирусосодержащегочающийсявыше ния эффективнве культуры тканиклеток щитовиднойществляют 250-32 дня при,37 оС,Источникипринятые во вним1. Патент СШАкл. 424-89, опуб Тираж 505 ПодписноеПИ Государственного комитета СССРейам изобретений и открытийМосква, Ж 5, Рвушсквя набд. 4/5 ППП "Патент, г. Ужгород, уп. Проектная е тени я ны дпя защитыгвстроэнтериесеивания исткани и сбора, о т и ис целью нов в качестт купьтурусвиней и осуов через 1