Способ количественного определения мебикара в биологических жидкостях

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сфюэ СоветеннвСфцналнетичееимаРеспублик п 943571(51)М, Кл. 6 О 1 й 33/48 3 ЪвударетаапаЯ камятет ьСФР ае делам яэебретеввЯ я атарытвй(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕБИКАРА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ Изобретение относится к медицине, в частности к исследование биологических жидкостей.Известен способ количественного определения мебикара в биологических жидкостях путем5 обработки пробы органическим экстрэгентом с последующим анализом экстракта методом газо. жидкостной хромотографии .Известный способ обладает малой чувствительностью (0,5 мг/мл), недостаточной для оп- о ределения мебнкара в биологических жидкостях человека, высокой трудоемкостью, длительностью выполнения, Применяемое сложное оборудование недопустимо для большинства клинических лечебных учреждений.Цель изобретения - ускорение и повышение чувствительности способа.Эта цель достигается тем, что в способе количественного определения мебикара в биологических жидкостях путем обработки органн ческим экстрагентом с последующим анализом экстракта методом газо. жидкостной хроматографии, отличительной особеююстью является то, что в качестве экстрагента используют хлороформ в соотношении 1:5-25, а в качестве хроматографического стандарта - 2,4,5,7, 8,10- гексаметнл,4,8,10-тетраазобицикло (4,4,0) декандион.3,9.Способ осуществляют следующим образом.Мебнкар экстрагируют из образца биологи. ческой жидкости 20-кратным объемом хлороформа 10 мин, разделяют слои, и экстракт упаривают. Сухой остаток растворяют в соот. ветствующем количестве 0,05%-ного хлороформного раствора стандарта, определяемого потабл. 1.Хроматографируют пробу при следующих условиях.Хроматограф газо.жидкостной ЛХММД, модель 5. Детектор пламенно ионниэационный, чувствительность по пропану 510 6. Масштаб регистрации 1/100.Колонка применяется длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм из нержавеющей ста. ли, заполненная 3. 01 17 на хромосорбс "9" (готовая коммерческая фзэа" фирмы "СЬееаро" (ЧССР) . Кондиционирование колон. ки осуществляется нагреванием до 260 в ре+943571 3жиме программирования в течение полуторачасов и дальнейшим выдерживанием при этойтемпературе 8 ч в токе азота. Температураиспарителя 250 С, Температура колонки 240 С,Режим изотермический, Газ-носитель - азот.Скорость на выходе из колонки 30 мл/мин.Вспомогательные газы: воздух - 300 мл/мин,водород - 35 мл/мин. Растворитель хлоро;форм. Концентрация растворов 0,05%. Времяудерживания мебикара - 1 мин. 50 с. Внутренний стандарт 2,4,5,7,8;10-гексаметил, 2,4,8,10 тетраазабицикло (4,4,0) декандион,9. Времядвижения ленты самописца - 240 мм/ч.Получение количественных данных. Длянахождения относительных калибровочныхкоэффициентов мебикара по стандартному веществу готовят смеси с точно известным, содержанием мебикара и стандарта в соотношениях 650:500, 500;500 и 350:500 н хроматографируют. В используемом узком диапазонесигнал детектора является линейным как поопределяемому, так и по стандартному вешест.ву. Относительная ошибка определения по дан.ным зцзлизз калибровочных смесей составляет2,4 3,3% (1=6; Р= 0,95).В качестве параметра для расчетов пиковиспользуют высоту (Н). Отсчет производятлинейкой с точностью до 0,1 мм.В табл. 1 приведено количество 0,05% хло.роформного раствора стандарта, необходимоедля растворения сухого остатка.Содержание мебикара в пробе для хроматогрзфнрования не зависимо от исходной концентрации мебикара в бножидкости равно содер.жанию стандарта и одной и той же величине,Добавляя стандарт таким образом нет необходимости в корректировке количества вводимойпробы и масштаба регистрации детектора. Исключается влияние искажений, связанных снелинейностью сигнала детектора по определяемому и стандартному веществам, отсутствуетнеобходимость в периодической проверке калибровочных коэффициентов в широком диапазоне. Чувствительность анализа составляет10-8 г,Возможные примеси, содержащиеся в хлороформных экстрактах, не влияют нз форму пиков и времена удерживания хроматографируе.мых веществ.П р и м е р 1, Количественное определение мебикара в моче человека (искусственныесмеси). Готовят точные растворы мебикара вмоче в концентрациях, указанных в табл. 2,Дезактивнруют ферменты нагреванием накипящей водяной базе 5 мин 2 мл приготов.ленной искусственной смеси помещают в цилиющр на 60 мл с притертой пробкой, закреп.ляют на шейкере в наклонном положении иэкстрагируют 10 мин. Водный слой удаляют 10 15 20 25 30 55 40 45 50 55 1 1отсасыванием. Хлороформную фрзкцию отго.няют иа роторном испарителе под вакуумомводоструйного насоса приблизительно дообъема в 2 мл и фильтруют экстракт черезворонку со стеклоткзнью в микрофлаконна 5 мл, Дополнительно омывают стенкицилиндров 2 мл хлороформа и добзвляютих через фильтр к экстракту. Экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остатокрастворяют в 0,5%-ном хлороформном растворе стандарта, как указано в табл. 1. 1 мклполученного растворз вводят микрошприцом виспаритель хроматографа. Измеряют отношениявысот пиков мебикара и стандарта. Содержаниемебикара вычисляют по формулеА = Х К 100,где А - содержание мебикзрз в мкг;Х - коэффициен 1, кратный опредсляемымконпентрзциям мебикзрз;К . относительный калибровочный козффи.циент.В табл, 2 приведены результаты определениямебикара в моче (искусственные смеси).П р и м е р 2, Количественное опрелеле.ние мебикара в плазме крови человека (искусственные смеси). Получают плазму из крови донора, содержащей 5% (по объему) 10%-ного раствора цитрата натрия, центрифугированием10 мин при 3000 об/мин. Готовят точные растворы мебнкара в плазме крови в концентрациях, указанных в табл. 3. 2 мл приготовленнойискусственной смеси помещают в цилиндр на60 мл с притертой пробкой и далее поступают,как описано в примеРе 1. Результаты определе.ний приведены в табл. 3.П р и м е р 3, Количественное онределение мебикзра в моче человека (больной Катасонов Ю, А., 43 года). Отбирают образцы мочидо приема мебикара (контроль) и в течениетрех суток после приема разовой дозы 0,6 г(перорально). Деэактивируют ферменты нагреванием на кипящей водяной бане 5 мин 2 млкаждого образца помешают в цилиндр с притертой пробкой и далее поступают, как описанов примере 1. Для коррекции количествз,стандарта, необходимого для растворения сухого остатка, проводят по 2 параллельных определения каждого образца мочи.Результаты определений мебикара в мочебольного приведены в табл, 4.Данные в табл. 4 показывают, что предла.гаемый способ позволяет определять содержание мебикара в моче человека, начиная смомента введения и кончая элиминацией изорганизма,При лабораторных испытаниях предлагаемо 4 го способа выявлены следующие преимущества по сравнению с известным способом: чувстви.Таблица 1 Содержание мебикарав биожидкостях Количество добавленного 0,05%-ного раст.вора стандарта 1 мл мкг в 1 мл в 2 мл300 1,2 0,8 0,4 50 0,2 100 25 50 0,1 50 0,05 25 12,5 25 0,025 6,25 12,5 12,5 Таблица .2 Содержание мебикара в 1 мл. мочи,мкг Найдено мебикара,мкг 267,1 89,02 0,93 2,3 2,5% 176,3 88,14 0,76 1,9 2,1% 86,78 100 86,78 0,54 1,3 1,5% 50 42,36 84,72 1,0 2,5 2,9% 20,66 82,64 25 0,83 2,0 2,4% 12,5 10,16 81,31 1,9% 0,64 1,6 6,25 4,69 75,16 3,1 4,1% 5 943571 тельность определения повышается в 510 а раз;извлечение мебикара иэ жидкостей выше всреднем повышается на 5 - 10%; время анализа сокращается в два раза; вместо хлористого метилена используется менее токсичный хлороформ; анализ упрощается благодаря применению доступного метода газовой хроматографии вместо протонной магнитной резонансной спектроскопии. Использование предлагаемого 4способа определения мебикара в биологичес. ких жидкостях по сравнению с известным способом обеспечивает воэможность определения мебикара в биологических жидкостях с высокой воспроизводимостью полученных данных, что важно для изучения фармакокинетики мебикара и позволяет уменьшить время, затрачи. ваемое на анализ, использовать доступное обо. рудо ванне. е Фактические измеряемые концентрации мебикара и стандарта в хроматографи. руемой пробе мкг(мл Метрологические характеристики при= 6, Р = 0,95943571 Т а б л и и а Метрологивеские характеристики при 1 6, Р 0,95 1,71 0,72 2,1 82,40 247,2 0,66 2,0 1,62 80,76 161,5 79280 1,62 0,66 7928 1,9 0,79 76,95 38,47 50 18,50 2,1 74,01 0,93 0.71 0,52 0,27 73,68 9,21 12,5 55 3,87 70,93 1,26 4,43 6,25 Конце мг(мл иэмереная 0,000 0,000 0,000 057Заказ 5097/49 Тираж 887 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная, 4 Способ количественного определения мебика. ра в биологических жидкостях, путем обработки пробы органическим зкстрагентом с по- % следующим анализом экстракта методом гаэожицкостной хроматографии, о т л н ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и повышения чувствительности способа, в качест 10ве зкстрагента используют хлороформ в соот.ношении 1:15-25, а в качестве хроматографи.ческого стандарта - 2,4,5,7,8,10-гексаметил.2,4,8,10-тетрааэобицикло(4,4,0) декандион.3,9,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Бочкарева О. М, Химико-фармацевтичес.кое изучение нового транквилизатора мебика.ра.