Способ количественного определения дезоксирабонуклеиновых кислот в биологических жидкостях

(57) СПО ЛЕНИЯ ДЕ сглаза,равд; НЙнм СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ С 3406132/1304.03,8223.10.83. Бюл, В 39(прототип). КИСЛОТ В БИОЛОГпутем обработкица раствором ДНонов,. изотопом, и сдержащей антителющей инкубациейн- ного комплексао т л и ч а ю щс целью повышенспособа, передционную смесь до1975 . фат в концентрацию осуществляю40 мин, а иммундают 3,5-5-нымИзобретение относится к исследованию биологических материаловс иСпользованием радиоактивныхмеченых веществ, а именно к количественному определению ДНК, и может быть использовано в экспериментальных и лабораторно-клннических исследованиях для диагностикипатологических состояний, сопровождающихся появлением ДНК в биологических жидкостях,Известны способы определения ДНКв биологических жидкостях, основанные на преципитации исследуемойДНК антителами к нативной ДНКОднако этот способ обладает низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью.Известен также способ количественного определения ДНК в биологических жидкостях путем обработкиисследуемого образца раствором ДНК,меченой радиоизотопом 1, И сывороткой крови, содержащей антителак нативной ДНК, с последующей инкубацией при 37 С в течение 1 ч и при04 С в течение ночи, осаждением имОмунных комплексов насыщенным раствором сульфата аммония при 4 С втечение 1 ч, определением радиоактивности в осадке и расчета коли;чества ДНК по калибровочной крови Г 2 Д .Однако известный способ являетсясложным и дпительным при выполнении,а также недостаточно чувствительным.Сложность обусловлена предварительным отбором сыровороток и использованием больших количеств меченогопрепарата " 1 дезоксиуридина свысокой удельной активностью. Чувствительность снижается вследствие диссоциации иммунных комплексов в полунасыщенном растворе сульфата аммония, Время определениясоставляет 18 ч.Целью изобретения является повышение чувствительности способа.Укаэанная цель достигается темчто при осуществлении способа требуется обработка исследуемого образца раствором ДНК, меченым радиоизотопом, и сывороткой крови,.содержащей антитела к нативной ДНК,с последующей инкубацией, осаждением иммунного комплекса и определением ДНК, перед инкубацией в реакционную смесь добавляют декстрансульфат в концентрации 13-16 и инкубацию осуществляют в течение30-40 мин, а иммунные комплексыосаждают 3,5-5,0-ным растворомполиэтиленгликоля в течение 1,5 -2 ч.Способ осуществляется следующимобразом,.Готовят реакционную смесь, состоящую из 20 мкл тестируемого образца, меченой радиоизотопом тритияДНК с массой, соответствующей2000 имп./мин в объеме 30 мкл и1 мкл сыворотки больного системной красной волчанкой, содержащей5 антитела к нативной ДЙК. Осаждаютбелки, неспецифически реагирующиес ДНК, добавлением 20-25 мкг декстрансульфата в 20 мкл и общий объемсмеси доводят до 150 мкл стандарт ным солевым раствором (0,15 М йаС 10,015 М цитрат натрия, 0,003 М трисНСО), РН 8,0.Смесь инкубируют 30 -40 мин при 37 С. Иммунные комплекосы осаждают в 3,5-5-ном раствореполиэтиленгликоля при 4 ОС в течение 1,5-2 чПолученный растворцентрифугируют в течение 30 минпри 3000 об;/мин и определяют радиоактивность надосадочной жидкости.Количество ДНК определяют по калибровочной кривой, построеннойаналогичным способом с известнымиколичествами ДНК.П р и м е р. Проводят определение концентрации ДНК в сывороткахбольных вирусным гепатитом. К 1 мклсыворотки больного системной крас-ной волчанкой, содержащей антитела кнативной ДНК, добавляют 20 мкл тестируемой сыворотки, 20 мкг декстранЗ 0 сульфата в 20 мкл стандартного солевого раствора, 30 мкл меченой радиоизотопом 9 Н ДНК 2000 имп/мин. (удельная активность 5 10 имп/мин) в этомже растворе, Общий объем реакционной 35 смеси доводят до 150 мкл стандартным солевым раствором (0,015 М цитрат натрия; 0,15 М хлорид натрия)с добавлением трис-НСГ буфера доконечной концентрации 0,003 М (РН 40 8,0), Смесь инкубируют 30 мин при37 ОС, добавляют равный объем 10-ного полиэтиленгликоля в том же буфере, полученную смесь перемешивают иоставляют при 4 фС в течение 2 ч. За тем полученный РаствоР центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин,и определяют радиоактивность надосадочной жидкости в 150 мкл смеси,нанесенной на бумажный фильтр.Количество ДНК в пробе определяют по калибровочной кривой, пост"роенной следующим образом: готовятреакционную смесь, состоящую иэ 1 мклсыворотки, содержащей антителак нативной ДНК, 30 мкл Н ДНК,20 мкг 55 декстрансульфата, 20 мкл разведенной сыворотки человека 1 г 100 и различные количества нативной ДНК от0,01 нг до 300 нг. Общий объем доводят до 150 мкл стандартным солевым 60 раствором с добавлением трис-НС 8 буфера до конечной концентрации0,003 М (рн 80) . Смесь инкубируют30 мин при 37 С, добавляют равныйобъем 10-ного полиэтиленгликоля, 65 перемешивают и оставляют при 4 С в1049803 Составитель П.БонарцевРедактор Н.Бобкова Техред М,КостикКорректор А.Зимокосов Заказ 8407/41 Тираж 873 , ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и.открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 течение 2 ч. Осадок отделяют цент" рифугированием и определяют радиоактивность надосадочнойжидкости. Используя полученные значения радиоактивности свободной ДНК, строят кривую зависимости. процента связан ной.меченной радиоизотопом Н ДНК от количества тестируемой ДНК, внесенной в реакционную смесь (см,чертеж .повышением концентрации опре- О деляемой ДНК, отношение между свободным и связанным лигандом уменьшается. Минимальная определяемая концентрация ДНК 0,03 нг впробе или 1,5 нг/мп, максимальная 2 нг в пробе или 250 нг/мл. Точка Ф, полученная путем экстраполяции данных отношения свободного и связанного лиганда для.определяемой концентрации . ДНК в сыворотке больного вирусным гепатитом соответствует 160 нг/мл сыворотки. Эффективность определения ДНК в присутствии декстрансульфата, определялась путем сопоставления калибровочных кривых, построенных аналогичным образом с добавлением декстрансульфата и без него.Чувствительность метода определения ДНК в присутствии декстрансульфата (кривая 1.) 1,5 нг/мл, а без декстрансульфата (кривая 2) 50 нг/мл.Таким образом, способ обеспечивает по сравнению с существующими упрощение метода за счет устранения предварительного отбора сыворотки, содержащей антитела к нативной ДНК; повышение чувствительности с 25 - 30 нг до 1,5-3 нг в пробе и сокращение времени определения с 18 ч до 3 ч.Устранение неспецифически реагирующих с ДНК белков при одновременном использовании нового осадителя дает воэможность испольэовать более широкий спектр антител. В результате удаления белков, неспецифически реагирующих с ДНК и конкурирующих с антителами за участки связывания, повышается чувствительность определения концентрации ДНК в биологических жидкостях.