Способ определения антител к антигену вируса гепатита дельта

( 9) (11) 51)5 6 01 76, 33 ОПИС ЗОБРЕ Я СК СВИДЕТ В А ОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТРИ ГКНТ СССР(71) Хозрасчетное опытное предприятие"Радиопрепарат" Института ядерной физики АН УЗССР(56) АВВОТТапс-ОЕЕТА,пзсгцстоп Мапва.АВВОТТ 1 аЬогаюгез, 1986,81 ле 1 то М., ЯЫп,),М.-Капб бегп ЗЛ.,ТЬе Ьер.а 1 Из В чгиз-аззосасеб бе 1 тааптдеп; газоатоп 1 гоп) Ичег, гречеорп 1 епт о 1зоИб-ревазе габоп)гпопоаззауз аког беИааптдеп апб апс-с 3 ейа апд рагт 1 а сЬагастегатоп о 1 беТа апбдеп, - Л.тп)опоч,125, М 1, р, 318-324, 1980,Вазыховой Ф.Г. Радиоиммунный методопределения маркеров дельта-инфекции иего применение для анализа полипептидного состава дельта-анти гена/Дис, насоискание ученой степени. Институт вирусологии им, Д,И.Ивановского, АМН СССР1 ч. 1988. Изобретение относится к вирусологии, иммунологии и иммунохимии и может быть использовано для изготовления радиоиммунологической тест-системы для диагностики гепатита дельта.Известны способы определения антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта), включающие выделение дельта-антигена, и антидельта, изготовление твердой фазы - пробирок, сенсибилизированных дельта-антигеном или антидельта, радиойодирование антидельта (изготовление 3-антидельта) и постановку радиоиммуноанализа в конкурентном или неконкурентном варианте. 1751681 А 1(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ ВИРУСА ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА (57) Использование: вирусология, иммуно-логия, иммуйохймйя"."Сущность изобретения," радиойодирование антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) проводят путем последовательного смешивания растворов йа 3, хлорамина Т из расчета125(0,1 - 0,5) 10 г хлорамина Т на 1 мКи 1 ча,) и раствора антидельта, При постановке радиоиммунологического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-энтигена. Способ используется для создания набора реактивов для радиоиммунологического анализа антител к антигену вируса гепатита дельта, 3 табл. Однако способы, предусматривающие сенсибилизацию пробирок дельта-антигеном, предполагают большой расход дефицитного (ввиду труднодоступности его источника) препарата дельта-антигена и высокую степень его очистки, что удорожает изготовление компонентов тест-системы и приводит к продолжительному контакту персонала лаборатории с высокопатогенным материалом, а способы, предусматривающие изготовление твердой фазы на основе антидельта, не обеспечивают высокой чувствительности анализа.Наиболее близким к предлагаемому является способ, включающий выделениедельта-антигена из постмортальной ткани. печени больных хроническим гепатитомдельта людей экстракцией гомогената печени, выделение антидельта из сывороткикрови больных гепатитом дельта хроматографией на сефадексе ДЕАЕ А, сенсибилизацию пробирок раствором антидельта,радиойодирование антидельта по классической методике с применение хлорамина Т,постановку радиоиммунологического анализа по следующей схеме; внесение в пробирки дельта-антигена; инкубация;промывка; внесение в йробирки исследуемых образцов; инкубация; промывка; внесение в пробирки 1-антидельтв; инкубация;125промывка; измерение связавшейся с пробирками радиоактивности; оценка результатов анализа,. Известный способ обладает достаточной специфичностью и не требует высокойстепени очистки дельта-антигена, однако онхарактеризуется трудоемкостью постановки анализа(3 операции внесения реактивов,3 инкубации, 3 отмывки) и относительнобольшим расходом дефицитного (ввидутруднодоступности источника выделения)препарата дельта-антигена. Кроме того, изготовленная на основе известного способатест-система уступает по чувствительностилучшим мировым образцам.Целью изобретения является упрощенйе методики постановки радиоиммунологического анализа, экономиятруднодоступного препарата дельта-антиге-на и увеличение чувствительностиспособа.Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу включающему выделение/дельта-антигена из постмортальной тканипечени, выделение антител к энтигену вируса гепатита дельта (антидельта) из сыворотки крови больных хроническим гепатитомдельта, изготовление твердой фазы - сенсибилизированных антидельта пробирок,радиойодирование антидельта с применением хлорамина Т и постановку радиоиммуйологического анализа, радиойодированиеантидельта проводят путем, последовательногосмешивания раствора Ма 3. хлорамина Т из расчета(0,1 - 0,5) 10 гхлораминаТ на 1 мКи йа Л и раствора антидельта, апри постановке радиоиммунолагическогоанализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-антигенаПредлагаемый способ отличается отизвестных последовательностью внесения реагентов в реакционную смесь припроведении радиойодирования, экспериментально подобранным для данной последовательности операций соотношениемколичества хлорэмина Т и радиоактивного мэтерив 1 а (0,1 10 - 0,5 10 г хлорами на Т на 1 мКи йэ 125.) и методикой постановкирадиоиммуноанализа - одновременным внесением в реакционные пробирки анализируемых образцов и дельтэ-антигенэ и совместной их инкубэцией с твердой фазой.Предложенная последовательностьвнесения реакторов в реакционную смесь(йа 3+ хлорамин Т+ белок), существенно10 отличающаяся от традиционной схемы ра-.диойодирования с применением хлооэминэТ(белокКэ 3 1- хлорамин Т) при экспе 125риментально подобранном соотношенииколичества хлораминэ Т и радиоактивного15 материала(0,1 10 - 0,5 10 г хлорэминаТ нэ 1 мКи йэ Л), приводит к увеличению125чувствительности способа в 1.5 - 5 раз (табл,1), При использовании хлорамина Т в количестве менее 0 1 10 г или более 0,5 1020 г на 1 мКи йа Л выигрыш в чувствительности от реализации данной схемы рэдиойодирования теряется (табл, 2).Кроме того, достигнутый выигрыш в чувствительности не теряется при постановке25 радиоиммуноанализэ по предложеннойсхеме, включающей одновременное внесение в пробирки исследуемых образцов ираствора дельта-энтигена и их совместнуюинкубэцию с твердой фазой, Таким обрэ 30 зом, методика постановки радиоиммуноанализа существенно упрощается: новаясхема предполагает две операции внесенияреактивов в пробирки, две инкубации, двеотмывки взамен трех операций внесения,35 трех инкубаций и трех отмывок по прототипу.Предложенная схема постановки радиоиммуноанализэ обеспечивает также.уменьшение расхода труднодоступного40 препарата дельта-энтигена. Оптимальнаячувствительность предложенного способадостигается при использовании для постановки радиоиммуноанализа разведенного в100 раз препарата дельта-антигена (табл. 3),45 При этом по предложенной схеме нэ одноопределение расходуется 50 мкл разведенного препарата, По прототипу тот же самыйпрепарат дельта-антигена разводится дляпостановки анализа в 50 раз, причем расход50 разведенного препарата на одно определение составляет 100 мкл, Следовательно, приреализации предлагаемого способа достигается четырехкратная зкономия дельта-энтигена на одно определение по сравнению55 с прототипом,Таким образом, проведение рэдиойодирования анти-дельта путем последовательного смешивания раствора йэ 3, растворахлорамина Т из расчета (0,1-0,5) 10 г хлона 20 25 30 40 45 50 55 рамина Т на 1 мКи йа Л и раствора анти 125дельта, а также внесение в пробирку при постановке радиоиммуноанализа раствора дельта-антигена одновременно с исследуемыми образцами обеспечивают увеличение чувствительности способа в 1,5-5 раз, упрощение методики поставки радиоиммуноанализа и четырехкратную экономию труднодоступного препарата дельта-анти- гена,Способ реализуют следующим образом,П р и м е р 1. Выделение дельта-антиге 4 г печени погибшего больного хроническим гепатитом дельта заливали 20 мл буферного раствора (состав, М: гуанидинхлорид 6; йаС 0,15; ЭДТА 0,025; трис-НС 0,05; рН 7,5), гомогенизировали 10 мин в гомогенизаторе Поттерэ и центрифугировали гомогенат в течение 30 мин при 100009, Надосэдочную жидкость сливали и использовали как препарат дельта-антигена,Выделение антидельта,5 мл сыворотки крови больного хроническим гепатитом дельта (РИА титр анти- дельта 1:200000) диализовали в теченйе 24 ч против 0,01 М фосфатного буфера рН 8,0. Раствор осветляли центрифугированием (100009, 5 мин) и наносили на колонку с сефадексом ДЕАЕ Аобьемом 20 мл, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером рН 8,0. Элюцию проводили тем же буфером. Оптическую плотность элюата регистрировали проточным денситометром Очсогс Р на длине волны 280 нм, Фракции, соответствующие пику оптической плотности, объединяли и диэлизовали против физиологического раствора, забуференного 0,01 М трис-НО рН 7,5, Концентрация белка в растворе, определенная спектрофотометрически с использованием соотношения С(мг/мл)=ОД 280/1,35, составила 0,75 мг/мл,Изготовление твердой фазы - пробирок, покрытых антидельта.Выделенный препарат антидельта разводили 0,2 М карбонатным буфером рН 9,5 до конечной концентрации 5 мкг/мл и вносили порциями по 150 мкл в полиэтиленовые пробирки вместимостью 1,5 мл, Пробирки выдерживали в течение ночи при комнатной температуры, удаляли раствор, трижды промывали пробирки дистиллиро-. ванной водой и высушивали при комнатной температуре.Радиойодирование антидельта (изготовление -антидельта)В коническую пластмассовую пробирку вместимостью 1,5 мл помещали 1,5 мКи Ма . в объеме 5 мкл; добавляли 5 мкл125раствора хлорамина Т с концентрацией 0,5 мкг/мл, перемешивали, выдерживали 30 с и вносили в смесь 60 мкл раствора энтидельта с концентрацией 0,75 мг/мл, Реакционную смесь тщательно перемешивали, выдержи-. вали 5 мин и наносили на колонку с сефадексом 6-25 Мосц гп объемом 15 мл,уравновешенную 0,05 М трис-НС рН 7,5 Элюцию проводили тем же буфером. Собирали фракции объемом по 0,5 мл. Фракции, соответствующие первому пику радиоактивностипо прибору ДРГДА - 1, объединя 125ли и разбавляли буфером (состав: 0,01 М трис-НС рН 7,5; 0,14 М йаС; 3% бычьего сывороточного альбумина: 5% сыворотки человека, не содержащей маркеров вируса гепатита дельта; 0,1% твин; 0,001% Бааз до обьемной активности 75 кБк/мл,Постановка радиоиммунологического анализа,В 4 сенсибилизированные антидельта пробирки вносят по 50 мкл отрицательного контроля (сыворотка крови человека, заведомо не содержащая маркеров вируса гепатита дельта), в 2 пробирки - по 50 мкл положительного контроля (сыворотка крови больного хроническим гепатитом дельта), в остальные пробирки - по 50 мкл неизвестных сывороток для анализа, Затем во все пробирки добавляют по 50 мкл разведенного в 100 раз буферным раствором (состав: 0,14 М КаС; 0,01 М трис-НС рН 7,5; 0,1% твин; 0,5% бычьего сывороточного альбумина) препарата дельта-антигена и перемешивают легким встряхиванием пробирок.Выдерживают пробирки в течение ночи при комнатной температуре.Удаляют содержимое пробирок и трижды промывают их дистиллированной водой,Вносят во все пробирки по 100 мкл препарата .-энтидел ьта с объемной.эктивно 125стью 75 кБк/мл,Выдерживают пробирки в течение 4 ч при комнатной температуре;Удаляют содержимое пробирок и пятикратно промывают их дистиллированной водой.Связавшуюся с пробирками радиоактивностьизмеряли при помощи однока 125нального ядерного спектрометра МР, Результаты анализа расценивали как значимые, если отношение среднего счета (зэ вычетом фона счетчика) положительных и отрицательных контролей было не менее 5. Положительными вданном тесте(т.е, содержащими антидельта) считали сыворотки, счет связавшейся, радиоактивности которых превышал полусумму средних значений счета положительных и отрицательных контролей.Относительная чувствительность реализованного таким образом способа составила 1:2000. 5Под чувствительностью метода принято понимать минимальное достоверно выявляемое данным методом количество вещества. Однако отсутствие общепринятого международного стандарта антидельта де лает прямое количественное определение чувствительности невозможным, Поэтому для сравнения различных тест-систем и способом определения антидельта по чувствительности (способ = тест-система+ ме тодика постановки анализа), относительная чувствительность определялась как максимальное достоверно положительное в анализе разведение одной и той же сыворотки больного хроническим гепатитом дельта. 20 Таким образом, полученные значения разведений применимы только для сравнения по чувствительности описанных тест-систем и способов между собой.П р и м е р 2. Осуществляли способ по 25 прототипу, за исключением этапа радиойодирования антидельта. Радиойодирование антидельта проводили, как описано в примере 1, Определяли относительную чувствительность изготовленных таким способом 30 тест-систем и тест-систем, изготовленных по прототипу (постановка радиоиммуноанализа при определении относительной чувствительности в обоих случая проводилась по . прототипу). 35Полученные результаты приведены в табл. 1,П р и м е р 3. Осуществляли способ по прототипу, за исключением этапа радиойодирования антидельта; Радиойодирование 40 антидельта проводили, как описано в примере 1, при этом концентрацию добавляемого раствора хлорамина Т варьировали от 50 до 0,05 мкг/мл. Таким образом, количество вносимого в реакцию хлорамина Т на 1 45 мКи йа 3 варьировалось от 0,25 10 до 0,25 10 г, Определяли относительнуючувствительность изготовленных тест-систем, Постановку радиоиммуноанализа при определении относительной чувствительности проводили по прототипу,Полученные результаты приведены втабл. 2.П р и м е р 4, Определяли относительнуючувствительность способа, реализуемого попримеру 1, при различных разведениях вносимого в пробирку на первой стадии постановки радиоиммуноаналиэа препаратадельта-антигена,Результаты приведены в табл, 3,Таким образом, проведение радиойодирования антидельта путем последовательного смешивания растворов йа 3,125раствора хлорамина в определенном количестве и раствора антидельта, а такжеодновременное внесение препарата дельта-антигена с исследуемыми образцамипри постановке радиоиммунологическогоанализа обеспечивают увеличение чувствительности способа в 1,5-5 раз, при этомупрощается методика за счет сокращенияколичества операций, а также четырехкратной экономии труднодоступного препаратадельта-антигена,Формула изобретенияСпособ определения антител к антигенувируса гепатита дельта, включающий выделение дельта-антигена из постмортальнойткани печени, выделение антител к антигенувируса гепатита дельта (антидельта) из сыворотки крови больных хроническим гепатитом. дельта, изготовление твердой фазы -сенсибилизированных антидельта пробирок, радиойодирование антидельта с применением хлорамин Т и постановкурадиоиммунологического анализа, о т л ич а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличениячувствительности способа, упрощения методики постановки радиоиммунологического анализа и экономии препаратадельта-антигена, радиойодирование антидельта проводят путем последовательногосмешивания растворов Йа 3, хлорамина Тиз расчета(0,1-0,5) 10 г хлорамина Т на 1мКи йа 3 и раствоРа антидельта, а при125постановке радиоиммунологического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-антигена,1751681 10 Таблица 1 Относительная чувствительность тест-систем при различных методах получения 1-антидельта 125Таб 2 блиц Относительная чувствительность предлагаемого способа определения антидельта в зависимости от разведения препарата дельта-антигена,вносимого в пробирку на первой стадии постановки радиоиммуноанализа,Составитель Л,Панфиловактор А,Лежнина Техред М,Моргентал Корректор Т. Вашков аз 2688 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при Г 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Относительна чувствительность тес радиойодирования по предлэгаемо количества вносимого в реакцию х систем при проведении у способу с вариацией рамина Т на мКи 1 ча,3