Способ получения полимерных носителей протеинов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПА 1 ЕНаУ Сказ Советскнх Сбцимистических Республик 1С 08 Рф 222/04 Гааударстаенный немнтет Совета Инннстроа СССР на делам нзааретеннй н атнрытнй(45) Дата опубликования описания 02,02.78 Иностранцы фритп Хюлер, Эрих Рауенбуш, Гюнтер Шмидт-Кастнер,Бруно Бемер и Херберт Бартл(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ПРОТЕИНОВ10 Изобретение относится к новым способам полимерных носителей протеиновИзвестен способ получения полимерных носителей протеинов путем бисерной сэполимеризации м,ф -моноолефинэвых ненасыщенных ангидридов дикарбоновой кислоты, преимушественно малеинового ангидрида, с ненасыщенным соединением, а именно атиленом и, соединениями моновинила в среде органических растворителей в присутствии инициатора полимеризации лри нагревании,Однако сополимеры ангидрида малеинэвой кислоты с этиленом и соединениями моновинила становятся при реакции с водными 15 растворами ферментов более или менее вода растворимыми, во избежание чего перед или во время - реакции приходится 1 добавлять сшивающий агент, например диамин. Полученные,акимобразом ферментные препа 20 рати относительно плохо фильтруются и имеют растворимые части, чтэ привэдит к потерям связаннэго фермента,Цель изобретения - создание способа получения полимерных носителей протеина, 25 обеспечивающего получение сшитых полимеров,Цель достигается благодаря гому, чтов качестве ненасыщенного соединения согласно изобретению используют ди- или полиакрилаг или ди- илипэлиметакрилат ди- илилолиолов в количестве 30-99% от весамонэмеров и процесс проводят лри 50-100 С.о 6,ф -М оноолефиновыми ненасьнценнымиангидридами дикарбоновой кислоты с 4-9,предпочтительно с 4-5 атомами углерода вмолекуле, которые можно использовать дляпэлучения сополимеров по предлагаемомуспособу, являются, например, ангидрид малеиновой кислоты, ангидрид итакоиовой кислоты,ангидрид цитраконовой кислоты, предпочтительно ангидрид малеиновой кислоты, Длясэполимеризации можно использовать смесиназванных ангидридов,Пригодные для сопэлимеризации лэ изобретению ди- и/или полиметакрилаты, и дни/нли лолиакрилаты ди- и/или полиолэв получают из соединений, имеющих це менее двухалкогольных или фенольных, предпочтительно алкогольных ОН-групп, илп продуктов ихреакции с Ялкецэксидами с 2-8, предпочтительно 2-4 атомами углерода иди сэ смесями таких алкецэксидэв, причем к 1 мэлю несущих гидрэксильцые группы соединенийприполимеризовыввют 1-10, предпэчтительно 1-20 влкецэксидцых структурныхэлементов, В качестве пригэдцых влкецоксидэв м Ожцэ цвэввть Окись этилена и Окисьпропиленв. Можно использовать также продукты реакции по Ыеревитицову соединений,содержащих не менее двух активных атомов водорода и полученных не из спиртовили фенолов, с вышеназванными влкенокси.дами с получением ди- и/или поли(мет)вкрилатов; 15Используемые согласно изобретению дни поли(мет)акрилаты ди- и полиолэв получают известными методами, например путемреакции ди- и/или полиолов с хлоридом (мет) акриловсй кислоты в присутствии примерно эквимолярных (в расчете на хлорид кислоты) . количеств третичных аминэз, например три,этиламинв. Реакцию проводят при темпераотурах киже 20 С в присутствии бенэола.В качестве ди- и полиолов, сэдержащихне менее 2, предпочтительно 2-12 атомов углерода, можно использовать этиленгликоль,пропандиол,2; пропандиол,3; бутандиолы, в частности бутандиол,4, гександиолы, декандиолы, глицерин, триметилолнропан, ЗО пентаэритрит, сорбит, сукрозу и прэдукты их реакции с названными выше алкеноксидами, Пригодны также поли-бис-хлорметилоксациклобутан или полистиролоксид, Можно применять смеси ди- и полиолов, 35Предпочтительно использовать дивкрилатыи диметакрилаты диэлов, имеющих 2-4 атома углерода, и/или продукты реакции 1 мэля этих диолов с 1-20 молями алкеноксида с 2 4 атомами углерода в,молекуле 40 в также триметилпропантриметвкрилвт.Ос обе цно целесообразно применять диметакрилаты,этиленгликоля, диэтиленгликоля, триэтилецгликоля, тетрвэтиленгли- КОЛЯ ИЛИ ВЫСШИХ ПОЛИВЛКЕНГЛИКОЛЕЙ С МОЛ. весом до 1000, а также смеси указанных С ОЕДИЦЕНИй.При желании .наряду с ди- и/или пэли(мет) акрилатами можно испэльээвать обычнэ применяемые сшивающие среды, имеющие це менее 2 цесэпряженных двэйцых связей, в именно дивиииладипатметилен-бис-вкрилвмид триакрилфэрмвль или триаллилцивнурат примешиваемые в количествеМпримерно 0,1-30% эт веса смеси мэномеров,Пользуясь возможностью весьма широковарьировать состав смеси мэцомерэв, можцо изменять гидрэфильность, плотностьсцники, цаэухаемэсть и содержание ацгидр 1 ццццх групп в получаемых сэпэлимерах а соответствии с их конкретным цаиичецием.Сэпэлимеры по предлагаемому способумогут быть пэлучецы, например путемс":длительной пэлимеризации в оргаццческэмрастворителе.причем полимеры цачицвюгвыпадать вскоре после начала полимеризвции.В принципе пригодны любые инертные к ацгидридным группам растворители. Наиболеецелесообразно испольэовать алифатические,циклоалифатические, ароматические углеводороды, а также галогензвмещенныеугле:водорэды, алкилароматические вещества исложный эфир карбоновой кислоты.Примеры подходящих растворителей; генотан, октан, иэооктан, фракции бензина, кипяо,щие примерно при 60-200 С, циклогексан,бензол, тэлуол, ксилол, хлорбенэол, дихлорбензэл, этилацетат, бутилвцетат.Растворители одолжны иметь точку кипения не менее 60 С и легко удаляться ввакууме иэ осажденного полимера. На 1 вес.ч.смеси мономеров применяют от 2 до 80,предпочтительно 5-20 вес.ч. растворителя,ФВид и количество использованного растворителя существенно влияют йа насыпной вес,удельную поверхность и другие свойства сополимеров. Во многих случаях желательноприменять смеси названных растворителей,Полимеризацию можно начинать в растворителе полимера, а потом непрерывно входеполимеризации добавлять осадитель полимера;Освдитель можно также вводить в определенные моменты одной или несколькими, порциями, Смесь мономеров можно вводить вместе с подходящим инициатором (в виде растсвора или беэ раствэрителя) в определенноеколичество растворителя. Тогда в процессеполимериэвции получается равномерная незначительнвя концентрация мономерв, Применяя(мет) акриловые мономеры с разнсй гидрофильностью и варьируя условия полимеризации, можно получать продукты с очень широким, соответствующим их конкретному назначению, диапазоном набухаемости, плотности,удельной поверхности и с хорошей механической стабильностью. Сополимеры по изобретению могут быть получены также методом суспензионнэй полимеризации. Наиболее часто применяемый вид бисернсй полимеризации, в ходе которой мэномеры (при необходимости с добавкой органических растворителей) суспендируют в воде, в данном случае мало эффективен,поскольку ангидрид очень быстро гидролиэуется, полученная дикарбоновая кислота переходит в Основном в водную фазу и лишь в незначительной степени внедряется в структуру полимера. Суспензионную полимеризацию целесэобразнэ поэтэму проводить в Оргвцичесот 2 до 20 мл/г, удельной поверхностью0,1-500, чаще от 1 дэ 400 м /г. Титрометрически определенное после омыленияангидридных групп содержание карбоксильных групп составляет от 0,02 до 10, преимущественно от 0,4 до 2 мг-акв./г.Суспензионные полимеры представляют собой белые иля слегка окрашенные бусинки,иногда неправильной формы, диаметром0,03-1, чаще от 0,05 до 0,6 мм, с насыпным объемом около 1,4-8, чаше 1,4-5 мл/г.Определенное после гидролиза ангидридныхгрупп содержание гидроксяльных групп составляет 0,02 - 10, преимущественно от0,4 до 4 мг экв/г.Полученные по изобретению сопэлимерысодержат статистически распределенныесополимеризационные структурные элементы.5 В связи с высокой плотностью поперечныхсвязей эти сополимеры не растворяются нив каких растворителях, Их молекулярныйвес не поддается поэтому определению.Сополимеры набухают в воде до 1,1-2,5- кратной величины ях насыпного объема. Онипрекрасно подходят для использования в качестве смол-носителей для фиксированиявеществ, способных вступать в реакциюс ангидридными группами сополимеров.Смолы-носители можно вводить при темопера 1 уре от 0 дэ 30 С непосредственнов водный раствор связываемого веществапредпочтительно в водный раствор протеина;рН должен при этом поддерживаться на постоянном уровне.Для связывания протеинов с сополимеромцелесообразно использовать рН-стат с уровнем рН от 3. до 10, предпочтительно от5,5 до 9,0. При применении в качествепротеина пенициллинапилазы рН целесообразно поддерживать на уровне 5,7-68. Дляподдержания постоянного рН в процессе реакции связывания необходимо непрерывно дэбав- лять основание. Для этого можно использовать неорганические основания, напримеррастворы едких щелочей, и органическиенэвания, например третичные органическиеамины,П р и м е р 1, 80 г тетраэтилеиглнкольдиметакрилата, 20 г ангидрида малеиновэйкислоты и 1 г нитрипа азоизомаслянсй кислоты растворяют в 1 л бензэла и перемешивают в течение 4 час при 60. С. Затемдобавляют 1 г 1 нитрила аэоизомаслянойкислоты я 200 мл бензина (т,кип. 100 кой среде, Мэномер я инициатор растворяют в несмачиваюшемся парафинами, инертном к ангидридцым группам растворителе, например ацетэнитриле, диметилфэрмамяде,диметилсульфоксиде, триамиде гексаметялфэсфорной кислоты,и распределяют - большей частью с добавкой диспергаторэв - и связанной фазе, В качестве связанной фазы наиболее пригодны парафиновые углеводороды, например гептан, октан и их высшие,гомологи, 10 циклоалифатические соединения, например циклогексан,а также смеси парафинсе, например фракции бензина или парафиновое масло. Объемное соотношение связанная фаза: моно- мерная фаза составляет от 1:1 до 10:1, 15 предпочтительно т 2:1 до 5;1.Для стабилизации суспензия м ожно ис .пользовать, например, глицеринмон о- или диолеаты и их смеси, сорбитанмоно- и триолеаты и стеараты, простой мэноафир 20 полиэтиленгликоля со стеарил- или лаурилспиртом или нонилфенолом, сложный моноафир полиэтиленгликоля с олеиновой, стев-: риновой и другими жирнымя кислотами, сэ,держащими более 10 атомов углерода, а 2 также натриевые соли сложного диоктилового афира сульфоянтарной кислоты. Эти.вешества применяют предпочтительно в количестве 0,1-10% (в расчете на количество смеси мономеров); растворяются они обыч но в углеводородной фазе. Величина частиц суспенэионных полимеров может быть уменьшена не только увеличением скорости перемешивания, но я добавкой 0,1-2,0% (в расчете на количество мономеров) дополнительного35 поверхностно-активного вещества, например алкилсульфоната,Пэлимеризация возбуждается радикальныминициатором. Пригодными инициаторами являютОся азосоединения преимушественн нитрил аэоиэомасляной кислоты, или персоединения, глав-ным образом диацилперекиси, например дибензоилперекись, или перкарбонаты, напримердииэопропил- или дицнклогексилперкарбонат, 45Для инициирования полимеризации можнотакже использовать диалкилперекися, гидро- .перекиси и эффективно действующие в органивских растворителях окислительно-восстановительные системы,Инициаторы вводят в количестве 0,01-16,предпочтительно 0,1-3% эт веса смеси мономеров,Полимеризацию осуществляют при темпераотурах 50-100 С (в зависимости от скорости распада инициаторов), большей частью ниже температуры кипения растворителя. ПриФбисерной полимериэации используется температура ниже температуры смешения обеих фаз,.60Жолатс.льно осуществлять полимериэацяю в атмосфере инертного газа, в отсутствие кислорода,Полученные путем осадительной полнмериэации сополимеры имеют слегка желтоватыйпвет или бесцветны, Это пэрошкоэбразцые вещества с насыпным объемом от 1,5 до 30, чаще7140 С ), Ыэйимеризацию продолжают еще5 час при 7 О С,оПэрошкоэбразныи полимер отсасывают,взмучивают один раз в бензэпе и три разав петролейнэм эфире (т, кип. 30-50 С)и сушат в вакууме. Выход 94 г.Свойства полимера."Насыпной объем, мд/г Зуц.Объем набухания в воде,мл/г 4,7Удельная поверхность, м /г 5,0Содержание карбоксильных, групп после омыпения ангидридных групп, мг-экв./г 3,5П р и м е р 2. Раствор 90 г этипенгпикопьдиметипакрилата, 10 г ангидрида мапеи,новой кислоты и 1 г нитрила азоизомаслянэй кислоты в 1 л" бензопа сначала переме.шивают при 60 С. Спустя 4 час добавляют200 мл бензина (т,кип. 100-140 С) и А гнигрила азоизомаспяной кислоты и нопимеоризуют еще 2 час при 70 С и 2 час при80 С.Полученный полимер отсасывают, тщательно промывают петропейным эфиром25(т, кип. 30-50 С) и сушат в вакууме. Выход 97 г.Свойства полимера: .Насыпной объем, мл /г 6,4Объем набухания в воде, мл/г 8,0 З 0Удельная пэверхйэсть, м/г 298Содержание карбоксипьныхгрупп после омыления ангидридных групп, мг-экв,/г 1,5П р и м е р 3, В результате сополимеризации 90 г диэтипенгликольдимегакрилагас 10 г ангидрида малеиновэй кислоты вусловиях примера 2 получено 96 г продукта,Свойства полимера;Насыпной объем, мп/г 55 40Объем набухания в воде, мп/г 6,7Удельная поверхность, м 7 г 9 2Содержапие карбоксильных групппосле омыления ангидридныхгрупп, мг-экв/ г 1,9,5П р и м е р 4. 80 г тетраэтиленгпиколь.димегакрилага, 20 г ангидрида мапеинэвэгкислоты и 1 г пэрэфора растворяют в 1 лбензопа и медленно перемешивают 16 часопри 80 С. Полимер подвергают обработке 50аналогичной эписанной в примере 1. Выходпродукта 95 г.Свойства полимера:Насыпной эбъем, мп/г 2,5Объем набухания в воде, мл/г 3,0 ффСодержание карбоксипьныхгрупп после омыпения ангидридных групп, мг-экв/г 2,6П р и м е р 5. В снабженном мешалкойсосуде нагревают в течение 1 час дэ ИО С Жо81 п бензина (т.в.ип, 100-140 С) и 1 гнетрила, азонзомаспяной кислоты, Затем приотмперагуре 80 С в течение 3 час вводятно каплям раствор 95 г этиленгликопьдимегакрилата 5 г ангидрида маленковой кислои 1 г нигрипа азэизомаспяной кислотыи перемешивают при эгэй же температурееше 2 час,Полимер о 1 сасывя юг многократно отм ывают бензолом и петролейным эфиром (т,кип, 30-,50 С) и сушат в вакууме, Выход продукта 96 ",Свойства полимера:Насыпной объем, мл/г 15,0Объем набухания в воде, мл/г 18,2.Удельная поверхность, м /г 70Содержание карбоксильных групппосле омыпения ангидридныхгрупп мгс-экв/г 0,5П р и м е р 6, Раствор 62,5 г тетраэтипенгликольдиметакрилага, 37,5 г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрипаазоизомаспяной кислоты в 150 мл бутилаце.тата и 1 л бензина (г,кип. 100-140 С,)ооперемешивают в течение 2 час при 70 С,2 час при 75 С и 1,5 час при 90 С.о оПолимер ргсасывают, экстрагируют в течение 24 час в экстракторе Сокслега и сушат в вакууме, Выход продукта 77 г,Св ойства полимера:Насыпной объем, мл/гОбъем набуханияв воде, мл/гУдельная поверхность, м 9 гУСодержание карбоксильныхгрупп после омыления ангидридных групп, мг-экв,/г 4,0П р и м е р 7. Раствор 90 г тетраэтиленглнкольдиме 1 акрилага, 10 г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасляной кислоты в 200 мп ацетонигрила суспенодируют в 1000 мл бензина (т.кип. 100-140 С)в котором было растворено 5 г смеси глицеринм оно-и диолеата, Реакционную смесь полимеризуют до образования твердых бусин околэ 2 час при 60 С и допэлнительно 20 часопри 65 С.Полимер отфильтровывают, трижды промы,вают бензолом и трижды петролейным эфиромо о(т,кип, 30-50 С) и сушат в вакууме при 90 С,Выход продукта со средним диаметром частицоколо 0,35 мм составил 94 г,Свойства полимера;Насыпной объем, мп/г 2,8Объем набухания в воде, мл/г 3,1Удельная поверхность, м /г 3,4Содержание карбэксильныхгрупп после омыления ангидридных групп,мг-экв./г 1,5П р и м е р 8, 18 г эфира диметакрипэвой кислоты н окиси полипропилена смоп, весом 1000 (число ОН-групп 112),589930 2,5 Составитель В. ПоляковаРедактор Г. Котельский Техред О. Андрейко Корректор М, Йемчик Заказ 415/42 . Тираж 641 Подписное БНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 92 г ангидрида маленновой кислоты и 200 мгнитрила азоизомасляной кислоты помещаютв ампулу, воздух вытесняют азотом и амлулу запаивают, После нагревания в течение 20 час до 65 С ампулу разрушают,полнмеризатный блок измельчают, триждысуспендируют в ацетоне н сушат при темопературе 50 С н давленнн 50 торр. Выходполнмера 18 г,Свойства полимера:Насыпной обьем, мл/г 2,3Обьем набухания в воде,мл/гСодержанне карбоксильныхгрупп после омыления ангндрндных групп, мг-экв./г 1,6 10 ф ормула из обре те нияСпособ получения полимерных носителей протеинов путем бисерной сополимеризации а/3-моноолефнновых ненасыщенных ангидрндов дикарбоновой кислоты с ненасыщенным соединением в среде органических растворителей в присутствий инициаторов при нагревании, о т л н ч а ю щ и й с я тем, что, с целью получения сшитых полимеров, в качестве ненасыщенного соединения нспользуют дн- или полиакрилат или ди- или полиметакрнлат ди- нли полиолов в количестве 30-99% от веса мономеров и процесс проводят при 50-100 С.о