Способ получения комплексных полинуклеотидов

О П И С А Н И Е 1 421202ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(61) Зависимый от патента(ЗЗ) США 0 (31) 37896 Государстеенвй комитат Совета Министров СССР во делам изобретений и открытий(088.8) 03.74, Бюллетень5 ия описания 14.08,74 та опублик 72) Авторы изобретени Иностранцы етер Лэмпсан, Альфред А. Тптел и Морис Ральф ХнллемаДжордж ртур Кирк Фил Иностранная фирма Мерк энд Компани, ИНК) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСН ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ2 тывают рибон дици ком екса обрабазвуком.астворы конозиновойкислота г900 мсится к области мучения препаратовотидов.получения комплеполи С и пОли 1ствительной системеполученный такимщенной токсичностщониндуцируОщей отн пол укл особ ов и в чу арат новь срфе сных утем осо по особ ют при охлннч в тече используя лучения. об оед личается тем, что ия или после оби сп 1 до ботки приведены в табл. 1.Т а блица 1 льтаты об Относительна чувствительность рибо- нуклеазы Продол 5 кительость звукового излучения, мин Гипархроматичность, ".,Относительна вязкостьеднпй Е65 и мол. ве 00 14 15 17 29 21,1 16,9 13,7 11,1 3,9 2,1 40 40 39 4,2 Х 10 2,3 Х 10" 1,2 Х 10 7,4 Х 10 5,6 Х 10 4,6 Х 10 2,8 Х 10 0,5 1,0 3,0 4,0 6,0 2,0 6,0 1,4 1,3 9,3 8,5 7,9 139 143 145 Изобретение ны и касается плекснлых поли Известен сп полинуклео 1 ил их соединения Однако преп бом, обладает ниженной ип постыл.разования компллеазой или ультрПример 1. Рненни полирнбоиОоцитпдилова 5рпблизптсльно1 .5 г/55 л нодвергазвУ 1 сОВОГО 15 злУчсриодов врсменп,тор звукового пз 63,5 62,5 62,0 62,5 61,5 61,0 60,0 58,5 71,2 70,7 71,7 67,0 67,0 67,0 59,049,0 мплек :гС и кс 51 ж ген не ра ДЛ 5 Э сного соедить (полири) обч смомнцснтрацпсй пи действьпо злнчных истого генера421202 Таблица 2 Сопротивляемость мышей заражению вирусной пневмониеи (РУМ) Ипдуцировапие пнтерферона в организ-,ме кроликовИспользуемое комплексное соединение г(,: гСизбыточное количество выживших мышей по сравнению с контрольной обработкой Действие звукового Доза на одного кролика, Относительная вязкость Титр иптерфе Лоза наодну мышь Средний мол, вес излучения,рона мкг мии мкг 7,8 Х 10" 640, 320 160, 320 4,01,00,25 94 80 60 0,002 в ,004 4,2 Х 10" 0,5 2,1 4,01,00,25 90 75 60 1,7 1,0 2,3 Х 10 4,01,00,25 47 55 20 1,4 3,0 1,2 Х 10 4,01,00,25 75 42 20 1,3 4,0 7,4 Х 10" 4,01,00,25 50 45 5(5, (5 0,0 П р и м е р 2. Каядый из частично деполимернзоваццых продуктов г 1: гС(с относительцьгми вязкостями 1,05 - -2,1), полученных и резулы ате действия звукового излучения на комплексное соединение г 1: гС, сравциваюг П р и м е р 3. Раствор полицуклеотидпого комплексного соединения (г 1: гС) концентрацией 1 мг/мл подвергают действию звукового излучения до относительной вязкости 1,3, пропускают через колонку, заполненную 4%-ной агаровой в виде шаровидных частиц (Сефароза В,), и элюируют сульфатно-соляным буферным раствором (0,006 М фосфата натрия, 0,15 М хлорида натрия, рН 7), используя объем элюата (Че), избыточный по отцошепию к объему пор (Чо). В результате такого хроматографцчсского разделения получают девять отдельных фракций, которые после действия звукового излус необработанным комплексным соединением г 1: гС, имеющим относительную вязкость 3,9,5 Результаты опыта привсдецы в табл. 2. Минимальная эффективная доза,вызывающая сопротивляемость живых клеток заражению вирусной пневмонией мышей,мкг/млчсния включают комплексное соединение г 1: гСп, имеюц 1 се средний молекулярньш вес в пределах от 6,0;х,10" до более 10.Резулыаты опыта приведены в табл. 3.10П р и м е р 4. Растворы отдельных гомополицуклеотидных полирибоцитидиловых кислот гС (Бю, 20=9,2) подвергают действию звуко.ваго излучения в течение 5 - 15 мин, Необра ботацная г 1 и гС, имеющая более низкиймолекулярный вес, полученная в результате действия звукового излучения, образуют комплекс с соединением г 1 п (5 ч, 20=9,2),20 Результаты опыта представлены в табл. 4,421202 6Таблица 3 Активность по отношению к фракции 1,% (сопротивляемость вирусной пневмонии в клетках)Доза на одного кролика,мкгТитр иитерферона сыворотки кроликаСопротивляемость заражению вирусом визикулярногостоматита (доза,мкг/мл) Титр интерферонаПродолжительность действиязвукового излучения, мин Относительная вязкость соединения г 1:гС0,002 - 0,004 3,0 0,001 - 0,002 1,7 0,002 в ,004 1,5 Контрольный (возбудитель отсутствует) с необработанной г 1(Ыч, 20=9,2) в эквимолярных количества,:, (Добавление раствора г 1 тотчас же прекращает разложение гС, под действием рибонуклеазы).5 П р и мер 5. Раствор гС(Ью, 20=9,2), содержащий 1 мг гСна 1 мл, обрабатывают панкреатической рибонуклеазой концентрацией 0,01 мкг/мл в течение 0 - 30 мин и фракции гСполученные при разложении рибонуклеазой, образуют комплексное соединение Результаты опыта сведены в табл. 5,Таблица 5 Результаты биологического анализа комплекса г 1: гСяРезультаты физического анализа комплекса г 1,: г С, Вирус визикулярного стоматита в клетках кроликаВремя обработки,М ишим ал ьна я доза,вызывающая сопротивление вирусной пневмонии мышей, мкг/млф) Минимальная доза (в мкг/мл), которая защищает не менее 40% обработанных мышей от неизбежного зара жения вирусной пневмонией, ЗОЬОьо фф) Приводится сравнение с нулевой пробой.421202 7 Табл цтса 6 Компоненты г С Компоненты г 1 в Относительна активностьклеток (сопротивляемость вирусному заражению визпкуляриым стоматигом 1, ",. среднийБг, 20мо, вес сречнее количество молекул нуклеотида:11 ен ьшсМсньпе Таблица 7 Сопротивляемость мышей изфекциогному заражению вирусной пневмозией1(онстанта седиментации лоза на Количествовьживших мьшейодну мы.ць,од уыпо отношениюмкг к оошсму количеству Избыточное количество выживших мышей по отношению к контрольным, о гС г 1 19,20 17,20 7, 20 9,2 410,25 9,2 88,3 78,3 78,3 10,25 3,Г 16,19 1720 5,20 9,2 87,5 78,3 68,3 8,20 5,20 2 20 410,25 9,2 3,0 33,3 18,3 3,3 3.04 6 20 5 20 1,20 3,0 23,318,30 1 0,25Контрольный 460 П р и мер б. ГозОполмеры различных молекулярных весов г 1 п и гСп синтезируют посредством регулируемой ферментативной по- лиме 1 зизяии дифосфятя инОзипа и днфосфата питидипд, соответственно, используя в кдчествс кдтдлизагора полиньяк,зсотидную фосфсПример 7. 1(, 250 мл раствора, содсрждпего 1 згДл гСп 15 в, 20 - 9,2) и фосф:т 1 осоляпом буферном рдсгворс, состоящем из 0,00 б М фосфята, 0,15 М хлоридя натрия имсющего р 1-1 7,0 добавляют 0,1 мл раствора, содсрждпего 0,25 мкг ЯИ 1 згЯТ 1 Сско: рбои, к. ,"еазы Л. Этот растзор тщательно псреме;пиг ают и подвергяОт фсрментативной обработке в течение примерно 90 мин, в рсзуль;ятс чего юлучают соединение гС(5 л, 20 - 2,5). Пр:- ъ ерно 250 мл раствора, содержа;Згс 1 О 7 ил высокомолекулярного гомополимера г 1 п в фосфатно-соляном буферном растворе добавляют непосредственно к раствору разложившегося полимера гСп (содеркащсго энзим рплазу, Погуче:ыс В 1 зсзультас го.ОгОлпмеРы 1 пТСРазличных молекУлЯ 1 зных весов образуют комплексные соединения в эквимолярпых количеспзах с высокомолекуляр:ы ми поли.,сРати Си и Г 1 п, СООВсстВсО.1 сзуды онита свсСИ 1, иЯО, и /,рибонуклеазы), и тщательно перемепшвают, В резусьг с егочспь оыстро ослабляется сктивОсть 1 зиоснклегзы и ООзьзусгСя коз 10 глскснос соединение г 1, ,и разложив:пегосяТСп. К раствору, содержащему комплексное СОЕДИНЕППЕ Г 1 п раЗЛОжИВШИНСя ГСп, доаВЛяют двои:ые обьемы охлажденыг д20 С) аосолотного этанола, и эгу смесь вы держивают в:ечепле приблизительно 15 часпри температуре - 20"С, осадок отделяют гСнтрифсг.,роваписз, промывают 200 мл этап а и высушивают, в результате чег полу- яетст В 1 зиолизитсльно 500 мг соединения 20 г 1: разлживппнся гСв виде белой волоки.Стой массы.421202 10 Таблица 8 Защита мышей от инфекционного заражения вирусной пневмонией Токсичность Комплексное соединение высоко молекулярного г 1 с одним из следующих соединенийчисло выживших мышей по отношению к обрабо- танным избыток вышивших мышей по сравнению с контролем, %общая доза на одну мышь, мкгобщая доза г 1:гС на однумышь, мкг Разложившийся г С 15/20 16/20 8/20 410,25 70 75 35 30,4 20/25 25/25 25/25 25/25 210,25 Высокомолекулярный г С 20/25 25/25 25/25 25/25 4,65 410,25 0,50,250,1250,063 13/20 16/20 9/20 60 75 40 Контрольный раствор (фосфатносоляной буферный раствор) 3/60 Составитель Т. Головина Техред А. Камышникова Корректор М. Лейзерман Редактор Д. Пинчук Заказ 1813/15 Изд.664 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская паб., д. 45Типография, пр. Сапунова, 2 Эту волокнистую массу (в количестве примерно 500 мг) растворяют в 100 мл фосфатносоляного буферного раствора, и добавляют к ней 0,1 мл 0,1 М раствора МЫС, (конечная концентрация 0,01 М МОС 12), в результате чего получается раствор, содержащий примерно 5 мг/мл комплексного соединения г 1: гС, Способность этого соединения, содержащего Следует отметить, что по сравнению с высокомолекулярным комплексньгм соединением г 1: гСкомплексное соединение г 1(разложившийся гС) сохраняет неизменную невоспреимчивость к заражению вирусной пневмонией мышей, но значительно снижает токсичность. Данные, рассчитанные по 1,0 зо, показывают значительное преимущество примерно в 6,5 раз (в отношении токсичности) комплексного соединения г 1(разложившийся гСп по сравнению с высокомолекулярным комплексным соединением), в то время как активноразложившийся гСзащищать мьпцей от инфекционного заражения вирусной, пневмонией по сравнению с соединением г 1: гС, полученным при использовании высокомолекулярных 5 гомополимеров как г 1 пч так и гСп, асравнительные токсичности этих двух комплексных соединений, приведены в табл. 8. число выживших мышей по отношению к обрабо- танным сти этих соединений как возбудителей интер 10 ферона почти одинаковы. Предмет изобретенияСпособ получения комплексных полинуклсотидов путем соединения поли С и поли 1 в 15 чувствительной системе, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью снижения токсичности и повышения интерферониндуцирующей способности, поли С и поли 1 до соединения или после образования комплекса обрабатывают рибо нуклеазой или ультразвуком,