Способ получения протеинов

ИЗОБРЕТЕНИЯ Зависимый от патентаКл, С 120 13,0 аявлено 1 О,Х,1967 ( 1189904,28риоритет 28,Х.1966,70720 бб,Комитет оо делам эобретений и открыти при Совете Министров СССР663.14(088 Опубликовано О,Х 1,1971, Бюллетень36ания описания 3.111.1972 та опубли Лвторыизобретения Иностранцыака, Такео Сузуки, Кен Ямаг(Япония)Иностранная фирмаКийова Хакко Когио Ко,(Япония) нобу Т и и Мазаки Ямамо Заявител ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВ ПО 11 по 1 у 11 Ке 1 од Ъасег хар акт Изобретение относится к микробиологиче.ской промышленности.Известен способ получения протеинов путем выращивания микроорганизмов, например Аг 111 гоЬас 1 ег, СогупеЬас 1 ег 1 цпл, Рзецдо 1 попаз аегцрпоза, Сапйс 1 а 11 роу 11 са, Азрегрцзогугае, на питательной среде, содержащейв качестве источника углерода углеводороды,например керосин, в присутствии водной минеральной среды, стимуляторов роста и кислорода. Однако при получении протеина известным способом протеин накапливаетсяв клеточных телах, а для его извлечения необходимо восстанавливать клеточные телаи затем подвергать гпдролизу, что значцтельно усложняет процесс,Предлагаемый способ позволяет получатьпротеины в культуральцой жидкости. Для этого в качестве микроорганизмов используютодин из штаммов Аг 1 ЬгоЬас 1 ег рага 11 пецз 202411-ЛТСС 15591, СогупеЬас 1 ег 1 ц 1 п ЬудгосагЬосаа 1 цз АТСС 15592, М 1 сгососсцз рага 1- сцз41-АТСС 15589, ВгеиЬас 1 ег 1 цгпц 1 аптсцпт2473-АТСС 15588, Лг 1 лгогозсорага 111 пцз1661-АТСС 15584, 25еризующихся следующими свойствами,А гг 1 тго 1)ас 1 ег рагаЦтеиз2411-А ТСС 15591Морфологические характеристики. 1, Разер: палочки, обычно 0,8 - 1,2(1 - 3 мк. 2. Клетки различаются по размерам и форме, Форма разнообразная (пскривлеццые, набухшие, разветвленные). 3. Подвижность; це подвижны, 4. Окраска по Граму неоднородная, Удлиненные клетки проявляют грамотр 1 щательнуто, В коккоидные - Грамполо)кцтельцук) окраску.Характеристики культивирования. , Колонии на питательной среде в виде агара; мясной экстракт 3 г, нептоц 5 г, агар (Отношение веса к объему) 1,5%, дистиллированная вода 1000 л 1 л - обильный рост, форма окружности, повсеместно светло-желтый, коричневый цвет, непрозрачный, блестящие. 2. Колонии на скошенном агаре. Обильный рост, волокнистые формы, возвышающиеся цлц плоские, непрозрачные, блестящие, светло-;келтые до серовато-коричневого, маслянистые.3. Питательный бульо 11: мясной экстракт 3 г, пептон 5 г, дистиллированная вода 1000 , -- слегка мутный незначительный хлопьевцдцый осадок,Физиологические характеристики и биологические свойства, 1, Оптимальная температура 20 - 30 С, незначительный рост црц 37 С.2. Оптимальное значение рН 6,0 - 8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробцые. 4, Реакция с лакмусом: нет измецешш нли щелочная, 5, Желатпн; не ожижается. 6. Сероводород: не вырабатывается. 7, Индол: не вырабатывается, 8, Крахмал; не гидролизуется, 9, Нц.трат: не восстанавливается до нитрита.10. Катализ - положительная реакция.11. Уреаза - положительная реакция. 12. Ферментация углеводорода. Штамм культуры растет хорошо, потребляя и-парафин как единственный источник углерода. Из н-парафина вырабатывает большое количество глютаминовой или уксусной кислоты, 13. Способность к утилизации углеводородов. Из фруктозы и маннита вырабатывает кислоты. При использовании уксусной кислоты или и-парафина на среде Гукера первичный кислый ортофосфат аммония не утилизируется в качестве источника азота. СогуггеЬас 1 еггит ЬуйгосагЬосазизАТСС 15592 Морфологические характеристики, 1. Палочки размером 0,8;(3,0 мк. 2. Коккопдные и разветвленные формы наблюдаются редко. Споры не образуются. 3. Не подвижны. Не устойчивы к действию кислоты. 4. Грамположительны. Характеристики культивирования, 1. Колонии на питательной среде из агара имегот округлую форму, гладкие или мелкоморщинистые, возвышающиеся до выпуклости, сплошные светло-розового цвета непрозрачные маслянистые. 2. Колонии на среде из скошенного агара: умеренный рост, волокнистая форма, блестящие или матовые гладкие или морщинистые светло-розового цвета, 3. Колонии на питательном бульоне; хрупкие в виде пленки.Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Воздействие на питательный желатин: ожижение отсутствует.2, Молоко остается неизменным. 3. В. С. Р. молоко; щелочная среда, не пептизируется, 4. Картофель: умеренный рост. 5. Нитраты не восстанавливаются до нитритов, 6, Проба на дыхание в присутствии нитрата; отрицательная. 7. Индол не вырабатывается. 8, Ацетилметилкарбшюл не вырабатывается. 9. Сернистый водород вырабатывается. 10. Крахмал не гидролнзуется. 11. В аэробных условиях из глюкозы вырабатывается кислота в соответствии с методом Хьюга и Лейфсона, 12. Из ксилозы, сукрозы, лактозы и крахмала не образуются ни кислота, ни газ. 13. Глюкоза, глюконат, цитрат, сукцинат, гг-оксибензоат и протокатехуат утилизируются в качестве единственного источника углерода. Салицилат, лг-оксибензоат, гентизат и антранилат не используются в качестве единственного источника углерода. 14. Керосин, н-декан, и-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан и н-цетан используются в качестве единственного источника углерода. 15, Оптимальная температура 25 - 30 С, скудный рост или отсутствие роста при 37 С. 16. Реакция с каталазой положительная. 17. Естественная среда и место распространения: почва,5 10 15 20 г 5 ЗО З 5 40 45 50 55 60 65 Мгсгососсиз рагауггго 1 у 1 гсиьЛ 41-АТСС 15589 Морфологические свойства, 1, Форма - сферы или короткие палочки. 2. Размер 0,8 - 1,2)(0,8 - 1,4 мк. 3. Подвижность - неподвижны. 4. Окраска грамположительная.Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: скудный рост. 2. Колонии на скошенном агаре: скудный рост, волокнистая форма, цвет - от светло-красного до красновато-оранжевого, маслянистые, блестящие. 3. Питательная среда в виде бульона: слегка мутная, компакт. ный осадок.физиологические характеристики и биологические свойства, 1. Оптимальная температура 25 - 37 С. 2. Оптимальное значение рН 6,0 - 8,0. 3. Потребность в кислороде; аэробные; случайно-анаэробные. 4. Реакция с лакмусом не изменяется, 5. Ожижения желатины не происходит. 6. Сероводород не вырабатывается. 7. Индол не вырабатывается.8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат восстанавливается до нитрита. 10, Реакция с ката. лазой положительная. 11. Отмечается превосходный рост при использовании н-парафина в качестве единственного источника углерода, при этом вырабатываются аминокислота и карбонильная кислота, особенно 1.-глютами новая и а-кетоглутаровая кислоты. 12, Ути лизация сахара: из фруктозы образуется кис лота. 13, Из глюкозы и магиюзы образуется незначительное количество кислоты. Из су крозы кислота не образуется. ВгеигЬас 1 еггипг Ке 1 од 1 и 1 атгситМ 2473-А ТСС 15588 Морфологические свойства, 1. Форма: обыч но палочки, редко удлиненные клетки, споры не образуются, 2. Размер 0,7 - 0,9(0,8 - 3,0 мк, 3. Подвижность: неподвижны, 4. Окраска по Граму положительная.Характеристики культивирования, 1, Коло. нии на питательной среде в виде агара: то. чечные гладкие сплошные непрозрачные и блестящие. 2. Колонии на скошенном агаре: умеренный рост, волокнистые формы, блестящие, цвет розовато-оранжевый, маслянистые, 3. Питательная среда в виде бульона: слегка мутная, пленки на поверхности, плотный оса. док,физиологические характеристики и биоло. гические свойства. 1. Оптимальная темпера. ту ра 25 - 37 С, и ри 37 С усиленный рост.2. Оптимальное значение рН 6,0 - 8,0. 3, Потребность в кислороде: аэробные; случайно. анаэробные, 4. Реакция с лакмусом пе изменяется или изменяется до щелочной, 5. Ожижения желатины не происходит, 6, Сероводо. род не вырабатывается, 7. Индол не выраба. тывается. 8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат восстанавливается до нитрита. 10. Ре. акция с каталазой положительная. 11, Реакция с уреазой положительная, 12. Отмечает 322888ся превосходный рост при использовании и-парафинов в качестве единственного источника углерода, причем вырабатываются а-кетоглутаровая, Е-глютаминовая кислоты и алании. 13. Утилизация схара; из глюкозы, фруктозы и сукрозы вырабатывается незначительное количество кислоты, мальтоза не утилизируется. А гйго 5 ас 1 ег гозеорагаЦтизЛ 1 бб 1-А ТСС 15584Морфологические свойства. 1. Форма: обычно короткие палочки. Клетки различаются по размеру и форме, наблюдаются сферические, эллиптические и удлиненцые клетки. 2. Размер 0,5 - 0,7;(0,5 - 3,0 мк, 3. Подвижность: подвижные, 4. Окраска по Граму отрицательная,Свойства культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: умеренный рост, нитевидные структуры, блестящие розовато-оранжевые маслянистые. 2. Питательная среда в виде бульона: слегка замутненная, рост на поверхности отсутствует, незначительный компактный осадок.физиологические характеристики и биологические свойства, 1. Оптимальная температура 25 - 37 С. 2. Оптимальное значение рН 6,0 - 8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробцые.4. Реакция с лакмусом не изменяется. 5. Ожижение желатины происходит в виде кратеров.6. Сероводород не образуется. 7, Индол це образуется. 8, Крахмал не разлагается. 9. Нитрат не восстанавливается до нитрита. 10. Реакция с каталазой положительная. 11. Реакция с уреазой положительная. 12, Отмечается превосходный рост при использовании и-парафинов в качестве единственного источника углерода, причем вырабатываются аминокислота и карбоновая кислота, особенно соответственно 1,-глютаминовая и а-кетоглутаровая кислоты. 13. Утилизация сахара: из глюкозы, фруктозы или сукрозы вырабатывается незначительное количество кислоты, 14. Образования аммиака (питательная среда в виде бульона) не происходит.Из приведенного выше следует, что данный микроорганизм имеет свойства, чрезвычайно сильно отличающиеся от соответствующих свойств известных микроорганизмов, потребляющих углеводороды,в процессе своего роста, особенно в отношении таких важных характеристик, как цветность окраски, подвижность, окраска по Граму, степень ожижения желатицы и использование сахара. К тому же не наблюдается образования кислоты из сорбитола и маннитола, кроме перечисленных выше сахаров. Свойства Рыис 1 огпопав аегуцтозаМорфология. Палочки размером 0,5 - 1,5 мк. 2. Встречаются единичными, спаренными и в виде коротких цепочек. 3. Подвижны, Обладают 1 - 3 полярными жгутиками. Монотрихин в соответствии с Рейдом, Наг 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 скцм, Фарреллом и Хейли.) 4. Грамотрицательные.Свойства культивирования. 1. Колонии на желатине желтоватые или зеленовато-желтые, окаймленные бахромой, неравномерные, похожие ца запутанный клубок, грацулцрованные, вызывающие быстрое ожцжецие, Царапины на желатине: быстрое ожцжецце, жидкость приобретает желтовато-зеленую или синевато-зеленую окраску. 2. Колонии на агаре крупные распространяющиеся сероватые с темным участком посередине ц просвечивающими краями, неравномерные, среда зеленоватая, 3. Колонии ца скошенном агаре обильные тонкие белые блестящие, окраска среды изменяется от зеленой до темно-коричневой или черной, флуоресццруют. 4, Колонии ца питательном бульоне: заметная мутность, толстые кожцстые пленки, обильный осадок. Среда желтовато-зеленая до синей, причем наблюдается флуоресцецция, затем коричневая. Часто образуются пцоццашш, флуоресцеин ц пирорубоиц.Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Реакция с лакмусом: образуется мягкий коагулюм с последующей быстрой пептоцизацией ц восстановлением лакмуса, реакция щелочная. 2. Картофель; пышный рост, грязновато-корпчцевый, среда становится темно-зеленой. 3. Ицдол обычно не образуется, 4. Нитраты восстанавливаются до нитритов и азота. 5. Глюкоза, фруктоза, галактоза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сукроза, декстрин, инулин, глицерин, маннитол и дульцитол не ферментизируются, Глюкоза окисляется до глюконовой кислоты, 2-кетоглюконовой кислоты и других промежуточных продуктов, 6. Кровяцая сыворотка сжцжается, желтая жидкость, зелецоватая на поверхности. Кровь подвергается гемолизу.7. Культуры имеют заметный запах триметцламина, 8, Аэробны случайно. 9. Оптимальная температура 37 С, хороший рост при 42 С.10. Патогенны для кроликов, морских свинок, крыс и мышей. Источник: гнойное отделяемое после ранений,Способ заключается в следующем. Культивируют один из штаммов вышеупомянутых микроорганизмов на питательной среде, содержаще йисточники углерода и азота, неорганические соединения и стимуляторы роста.В качестве источника углерода используют углеводороды, например керосин. Могут быть использованы парафины (алканы) с прямыми и разветвленными цепями, содержащие 5 - 15 атомов углерода, например н-пентан, н-октац, н-декац, н-додекан, и-гексадекан, изопентан, изооктан и так далее, циклопарафины, например циклогексан ц ццклооктац, олефины с прямыми и разветвленными цепями, например пентен, гексец, октен, октени другие; циклоолефицы, например циклогексен и циклооктен; ароматические углеводороды, например бензоп, оксилен и так далее, и их смеси, смешанные углеводороды, например легкие, тяжелые, парафиновые масла и т. д,Вместе с углеводородом или углеводородной смесью в ферментационную среду могут быть введены небольшие количества таких углеродных источников, как глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, сахароза, крахмал, гидролизат крахмала и так далее, или другой подходящий источник углерода, например глицерин, маццитол, сорбитол и т. п.В качестве источника азота могут быть использованы различные виды неорганических или органических солей или соединений, например мочевина или аммиак и его соли, такие как сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония и другие, или природные вещества, содержащие азот, например кукурузный напиток, пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, казеиновые гидролизаты, рыбная мука и т. д, Могут быть применены также смеси из двух и более перечисленных веществ.К неорганическим соединениям, которые могут быть добавлены в культуральную среду, отцосятся сренокислый магний, дигидрогецфосфат калия, моногидрогенфосфат калия, хлористый натрий, сернистое железо, хлористый марганец, хлористый кальций и другие обычно применяемые соли магния, железа, марганца, цинка, кальция и т. п. Могут быть применены и смеси таких нероганических соединений.Кроме того, в культуральную среду могут быть введены питательные вещества, существенно необходимые для роста данной особи, например такие витамины, как биотин, тиамин, пантотеновая, и-аминобензойная, никотиновая кислоты и так далее, и различные аминокислоты, например глютамицовая кислота,Ферментацию проводят в аэробных условиях, например в условиях аэробного встряхивания культуры или помешивания погружной культуры с одновременным введением в нее стерилизованного воздуха при 20 - 60 С.В процессе культивирования поддерживают рН среды 4 - 10 (предпочтительно 6 - 9) путем добавления мочевинного раствора аммиачной воды, аммиачного газа, углекислого аммония и т, д. Ферментацию проводят в течение 1 - 2 дней.Целесообразно добавлять антибиотики, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты в качестве стимуляторов роста. Из антибиотиков можно использовать пенициллин, бацитрацин, стрептомицин, циклосерин и т. д.Поверхностно-активные вещества включают реагенты не ионного, катионного, анионного или амфотерного типов, Наиболее эффективными являются жирнокислотные эфиры полиоксиэтиленсорбитана (Сд в С, серия твин) ч их алкиламиновые соли (Св - С 1 в), полиоксиэтиленалкиламины (С - С,в, серия Наймин), полиоксиэтилецалкилалил эфиры(Сд - Св), алкилтриметиламмониевые галоиды (С 1 в - С 1 в), алкилбензилтриметиламмониевые галоиды (Св - С 1 в), алкилпиридиновыегглоиды (С,в - Св), алкилбетоины (С 1 в - С 1 в)5 и другие.Пригодны также различные высшие жирные кислоты, цапримср олеиновая, пальмитиновая, стеариновая и тому подобные, и ихсоли и эфиры, например сорбитацмоноолеат,10 эфир полиоксиэтилепгликольолеиновой кислоты, полиоксиэтиленгликольпальмитиновой кислоты и т. д. Эффективно действуют и различные комбинации этих соединений,После завершения ферментации полученный протеин отделяют обычным способом, например цецтрифугированием, осаждениеми т. и,П р и м е р, Аггигоаас 1 ег рагаЦтеизМ 2411-ЛТСС 15591 культивируют в злачной20 среде, содержащей 1,0% мясного экстракта,1,0% пентоца и 0,5% хлористого натрия, рН(до стерилизации) 7,2, путем аэробпого потряхивания в течение 24 час, Культивированную таким образом бактерию прививают в25 10%-цой (по объему) пропорции в 3,0 л ферментационной среды, находящейся в 5-литро.вом вибрационном бродильном чане.Ферментационная среда имеет следующийЗо состав %:КвНР 04 0,2Мо 504 7 НвО 0,1Мп 504 4 НвО 0,002Ре 504 7 Н 20 0,02Хп 50 7 Н 20 0,001ХН 4 ИОз 0,5Кукурузный напиток 0,1.В начале культивирования в ферментациснную среду добавляют 100 мл смеси н-пара 40 финов, содержащих 11 - 18 атомов углерода.,Культивирование проводят при помешиваниисо скоростью 600 об/мин и аэрации стерильным воздухом при 30 С в течение 40 час.Значение рН культуральной среды регули 45 руют в пределах 6,5 - 7,5 .путем добавленияво время культивирования аммиачной воды.По окончании культивирования количествопротеина, полученного в водном растворе, составляет 7 г/л.50 Затем рН водного раствора, полученногопутем центробежного отделения ферментационной жидкости, доводят до 3 - 4. Центробежное отделение полученного протеина дает19 г сырого протеина. Последний снова рас 55 творяют в воде (при рН 7 - 8) и этот протеиносаждают при рН 3. - 4.Вновь проводят центробежное отделение.Эти операции повторяют дважды. После суш:- ки при температуре ниже 0 С получают 17 г60 очищенного протеина.Предмет изобретенияСпособ получения протеинов путем выращивания микроорганизмов, например ЛгйгоЬас 1 ег, Согупе 1 эас 1 егшгп, Рзеидогпопаэ аегурпоьа,Заказ 160/1 Изд. Хз 1785 Тираж 473 Подписное ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Типография, пр. Саг;унова, 2 Сапс 1 Ыа 11 ро 1 у 11 са, Азрегр 11 цз огукае, на питательной среде, содержа 1 цей в качестве источника углерода углеводороды, например керосин, в присутствии водной минеральной среды, стимуляторов роста и кислорода, отличающийся тем, что, с целью получения протеинов в культуральной жидкости, в качестве микроорганизмов используют один из штаммов Аг 1 ЬгоЬас 1 ег рагайпецз2411-АТСС 15591, СогупеЬас 1 ег 1 цгп Ьус 1 госагЬос 1 аз 1 цз АТСС 15592, М 1 сгососсцз рага 111 поу 11 сцз41-АТСС 15589, ВгечЬас 1 ег 1 цгп Ке 1 одц 1 агп 1 сцгп2473-АТСС 15588, АгйгоЬас 1 ег гозеорагайпцз1661-АТСС 15584,