Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis var кursтакi для получения инсектицидного препарата

(2 (8 Америки, предговли (ОЗ)лис А.В. Мартин тво СССРО, 1984.РИЙ ВАС 1 Ш 38ЯНТАК ДЛЯ ПОЛНОГО ПРЕПАРААвторское свидетел 69787, кл. А 01 й 63ШТАММ БАКТЕ ОЯ 11 т 16 ЕЙ 55 ЧАЙ КО ЕНИЯ ИНСЕКТИЦИ Т 5010514/13 4742274/13 13.10.89 РСТIОЯ 88/01560 (11,0 14.11.91 30,08.93, Бюл. М 32 0500450 18.05.87Соединенные Штаты вленные Министром тор Рассел С. Трейверз и Фил(57) Использование: микробиологическая. промышленность, производство средств защиты растений от насекомых. Штамм бактерий Вас 1 Ицв 1 Ьцг 1 пд 1 епз 1 з получен из почвенного слоя неклассическим способом отбора посредством ацетата натрия и тепла.Штамм депонирован в коллекции культур в Северном регионал ьном исследовательском центре департамента сельского хозяйства, США, Пеория под ЬВ Мйй В -18196, штамм является спорогенным, кристаллообразующим и уникальным в том, что требует для роста, споруляции и образования кристаллов питательной среды, содержащей лейцин и валин. Инсектицидный препарат, полученный на основе этого штамма, явля- с ется высокоэффективным против чешуекрылых насекомых, в частности совки капустной и импортированных мермитид. 1 табл.Изобретение касается получения нового инсектицидного препарата на основе нового штамма Вас 1 цз йцг 1 п 91 епз 1 в Чаго гп гг 1 зоп 1 МЯВОМ В -18196.Инсектицидный препарат используется дл борьбы с видами насекомых отряда Чешуек ылых, в частности, ТЮ СНОРЛ 331 АМ, "совк капустная" и АВТООЕ 1 А ВАРАЕ портированные мермитиды",Спорообраэующий микроорганизм В. Мг 1 п 91 епз 1 з был изолирован свыше 80 ле тому назад, и стех пор стал коммерчески и вестным в отношении биологической б рьбы с вредителями. Спорообразующие к тки ВА 1)цгп 91 епзз каждая продуцирует с рутандоспору) и ромбоаидний беляк аий кристалл тпа реп пору или тельца екл юч ения). Э томоцидные свойства приписываютсяо б-эндотоксину, который явным компонентом параспористалла, Когда кристалл астворимое состояние в кишке н вызывает образование прорый активизируется в результического расщепления,Являясь довольно специфич дом в отношении Чешуекрылых н и некоторых мух и мостиков, Влйц является безвредной по отноше восприимчивым отрядам насеком тным и человеку. В настоящее вре В. Вцгп 9 епзз разновидности включает инсектицидные про Фцг 1 п 91 епз 1 з, наиболее широко и мые для борьбы с этими вредителя исключительляется осно рального кпереходит в рнасекомого,токсина, кототате протеол еским виасекомых гп 91 епз 1 з нию к неых, живомя в США.сц гзтэ Ы дукты В. спользуеми. Одна ко зти продукты недостаточно эффективны при промышленном применении.С другой стороны, синтетические пиретроиды являются химическими инсектицид- ными агентами, наиболее широко используемыми для борьбы с Чешуекрылыми вредителями. Пиретроиды являются высокоэффективными и обеспечивают более сильную борьбу с вредителями по сравнению с используемыми в настоящее время инсектицидными продуктами Влйцг 1 пдепзз, Однако недостаток, связанный с использованием пиретроидов, состоит в том, что они являются токсичными в отношении непреслед,емых беспозвоночных, тем самым представляя опасность для окружающей водной среды, Поэтому существует потребность в эффективных активных против чешуекрылых инсектицидах, которые безопасны для окружающей среды, эффективны по стоимости и которые дублируют эффективность синтетических пиретраидав.Цель изобретения состоит в получении инсектицидного препарата на основе нового штамма ВЛшг 1 пц 1 епзз Чаг, глагг 1 зап Ийй 1 Вдля уничтожения видов насекомых отряда Чешуекрылых, в частности Тгс 11 ор 1 оз 1 ап 1, "совки капустной"и Агоде 1 а гарае,"импортирооанными мермитидами"Новый штамм В,с 1 шг 1 пц 1 епз 1 з был депанирован в коллекции культур в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория, Иллинойс 91604, под регистрационнь 1 м номерам ййй 8-18196. Потомство этого штамма будет относиться к Мйй 1,Новый штамм является спарогенным, кристаллообразующим мутантным штаммом выделенных из окружающей среды В, йиг 1 пц 1 епз 1 з и имеет способность продуцировать бипирамидальные кристаллы, состоящие иэ токсичного белка, и является уникальным в том отношении, чта является ауксотрофным по лейцину и валину для раста, споруляции и продуцирования кристаллов. В противоположность этому ранее наблюдаемые штэммы В. йиг 1 пд 1 епз 1 з проявляли ауксотрофнасть, которая удовлетворялась без аминокислоты, К,Я,К 1 с 1 егсоп ет а 1, Арр 1, М 1 сгоЫо 1, 28, 124-128 1974),Термин "ауксотрофия" здесь определяется в значении потребности в питательных веществах. необходимых для роста, спаруляции и продуциравания кристаллов микроорганизма.Фраза "амина-кислотный комплекс питательной среды" определяешься здесь для обозначения питательной среды, содержа 45 50 55 Штамм Мйй 1. Вб имеет следуащие характеристики; колонии являются круглыми, цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметром колонии 2-7 мм на питательном агаре после 24 часов. Вегетативные клетки являатся азробными, грамположительными, падоижными палочками размером 1-1,2 мкм на 3-5 мкм. Концевые верхушечные) споры вегетативных клеток не раздувают спарангий и составляют от 33 до 50 ",4 вегетативных палочек, Клетки являатся положительными па каталазе, ферменту глюкозы, гидрализу казеина, на вопреки таксанамическаму описанию прежде набладаемых штаммав В, еЬог 1 пц 1 епз 1 з штаммы согласно изобретению не используют цитраты, Новый штамм также не ферментируат маннит, арабиназу и ксилозу. щей комбинацию двух или более аминокислот.Новый штамм чйй Вразмножениз почвенного слоя, используя неклассиче 5 ский способ отбора посредством ацетатанатрия и тепла, В соответствии с этим способам водная питательная среда буферизуется примерно да 0,25 М ацетатом натрия,чтобы допустить зарождение только неже 10 лательных спораобразующих организмов,присутствующих в образце окружающегопочвеннага слоя, Затем выращенныеспараабразуащие организмы и неспорообразующие организмы в образце умерщвля 15 лись путем тепловой обработки. Выжившиеспоры после зтага высеивались на чашки ивыращивались на соответствующей агаровой питательной среде для получения новыхштаммав согласна изобретению, Не прибе 20 гая к какай-либа конкретной теории, предполагается, чта навье штаммы согласнаизобретению абразуатся ва время процесса отбора в результате мутагенеэа, естественна происходящего в штаммах25 ВлЬг 1 пцепзгз с последующей обработкойацетатам натрия и теплом,Примером способа селекции являетсяследуащии: 0,5 г почвы была добавлено в 10млс 1-бульона 100 млс воды, 1 г таиптана,30 0,5 г экстракта дрожжей, 0,5 хлористого натрия) в 115 мл дефлектарнай колбе.1-бульонбыл буферизаоан да 0,25 М ацетатам натрия, Смесь встряхивалась в течение 4 часовпри 250 аб/мин и 30 С. После испальзава 35 ния пратачнагатегглавагаустрайства пастеризации смесь нагревалась при 80 С втечение 3 минут. Термаабрабатанная смесьвысеивалась на чашки с-агарам ( - бульон, атвержденный с помощью 1,5 О агара)40 и инкубиравалась в течение ночи (19 часов)при 30 С.10 20 25 качестве активного ингредиента в укаэан 30 35 45 50 Дополнительно штамм Нйй В г дролизовал крахмал, ферментировал саароэу и продуцировал лецитиназу; клеткие использовали эскулин, не продуцироваи уреазу, не ферментировали салицин и У. 5тамм является стойким по отношению кнтибиотикам пенициллинового типа, таим как иафициллин, ампициллин и метииллин, и является стойким по отношениюнизким уровням, т,е. около 10 г/мл, неомиина, канамицина и бромида этида,Как сказано выше, продуцированиепор и белковых кристаллов штаммом В.Ьцгпдепэз имеющим характеристикийй В, требует водной питательнойреды, которая содержит лейцин-валиноый аминокислотный комплекс, Для оптиального образования кристалла бактериейогласно изобретению предпочтительныйостав специальной питательной среды явяется следующим: 0,3 о триптона, 0,2 7 Ориптозы, 0,45 % дрожжевого экстракта,олученного 0,01 М в буфере фосфата йария при рН 6,8 с добавлением 10 МдЯО 410 Мп 504 после обработки вавтоклаве.Штамм выращивают при температуре0 С при 250 об/мии в 2-хлитровых коиичеких колбах Эрленмейера с тройными переородками с объемом 25 о и хранят приемпературе 25 С на среде ТЗ, отвержденой 1,5 О, агаром.Другая соответствующая питательнаяреда, имеющая. требуемый аминокислотый комплекс, может использоваться дляыращивания бактерий согласно изобретеию. Однако используемая иная питательая среда, нежели предпочитаемаяитательиая среда, может привести кменьшенному образованию кристаллов.Продуцироваиие клеток производится в 4эробных условиях при любой температуре,довлетворительиой для роста микроорганизмов согласно изобретению, т.е, примерно от 10 С до 40 С; предпочитаемыйиапаэон температуры между 27 С и 32 С.Величина рН питательной среды, соответствующей для выращивания культуры В.Ьцгпдепзз близка к нейтральности, т,е.рН от 6,7 до 7,2. Время инкубации являетсявременем, необходимым для полного освобождения споры и кристалла,и предпочтиельно составляет от 18 до 24 часов. Клеткимогут выращиваться в любой дефлекториойвстряхиваемой колбе в ряде небольшихопытов. Для операций в более крупных масштабах удобно выращивать культуру в резервуаре, применяя помешивание иаэрацию в отношении инокулированнойжидкой питательной среды, После инкубации клетки собираются традиционным способом седиментации, как, например. центрифугироваиием или фИльтрованием. Клетки могут использоваться как таковые или в замороженном виде для последующего использования,Для получения инсектицидной композиции, содержащей штамм В.аког пдепзз чаг, воггзоп ййй Вв качестве активного ингредиента, штамм, который составляет до 30 ф общего объема, смешивают с инертными ингредиентами, которые составляют остаточный объем, т,е. по крайней мере 70 о общего объема, Инертный ингредиент может быть просто разбавителем, например, вода.Другие инертные ингредиенты могут включать консерванты, агенты, контролирующие текучесть, клеющие вещества, эмульгаторы, распыливающие вещества,поверхностно-активные вещества, наполнители и буфер. Используемый интервал доз составляет от 1,1 х 10 до 5.10 спор наЮ 12 0,405 га, Инсектицид, содержащий мутант В, йогпдепзз чаг воггзоп Мйй Вв ных дозах, является высокоэффективным в уничтожении насекомых отряда чешуекрылых, в особенности, совки капустной и импортированных мермитид (см, табл, ниже). Пример способа получения инсектицидного препарата включает смешивание вместе с использованием воздушной мельницы, чтобы обеспечить размер частиц и гомогенность штамм ййй В,составляющий до 30общего объема с инертными ингредиентами, которые составляют остальной объем. Эти инертные ингредиенты включают консерваит, два поверхностно-активных вещества, агент регуляции текучести,разбавитель и буфер. Смесь затем гранулируется с использованием техники сжатия (уплотнения) и упаковывается в воздухонепроницаемые, не содержащие влаги контейнеры. Инсектицидиые препараты могут, разбрызгиваться с использованием традиционных методик и разбрызгивающих устройств. Новый инсектицид может также иикапсулироваться или заключаться в соответствующий инкапсулирующий материал, как органический полимер, и применяться в порошковой форме. Также предусматривается, чтобы генетический материал для б-эндотоксииа нового штамма В. йцгпдепзз мог быть перенесен с использованием техники рекомбииатиых ДНК в другие бактерии и растения для обеспечения усиленной борьбы против вредителей.Нижеследующий пример предназначен иллюстрировать изобретение и ие ограни 1837773чивает объем притязаний, как он определен формулой изобретения.В полевых испытаниях эффективность инсектицида, содержащего штамм НВЙ В в качестве активного ингредиента, против совки капусной и импортированных мермитид сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид, "ПИДРИН" и инсектицидного продукта В. Фцг 1 пд 1 епзэ разновидности Курстаки "ДИПЕЛ Ь", "ПИДРИН" является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой "Шелл корпорейшн", и содержит 30 % циано (3-феноксифенил) метил-схлоральфа (1- метил)тип) бензолацетата и 70 инертных ингредиентов, "ДИПЕЛЬ" является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой "Абботт пабораториз," и содержит 3,2 % В. Эцг 1 пд 1 епз 1 з разновидности Курстаки и 98,8 Оинертных ингредиентов.Также испытывались два других новых инсектицидных препарата, содержащих в качестве активных ингредиентов штаммы ВлЬцг 1 пдепэз чаго йцзмаг ИВВ. Ви В. Инсектициды на основе новых штаммов Яйся В, Ви 8-18196 содержали 5,5 х 10 спор на 0,5 л воды, 0,01 % общего объема составлял жидкий детергент(добавленный в качестве распыливающего вещества) и остальной объем составляла вода.На Восточном берегу Мериленда капуста листовая была прямо высажена семенами в 4-х рядных делянках по 609,60 см длины 07 июля 1986 г. Растения отстояли доуг от друга на 5.08 см в ряду и 91.44 см между рядами. Обработка была организована по схеме рандомизированных блоков с 4 повторами. Каждый ряд был буферизован защитным рядом. Почва была супесчаной почвои Норфолк "А". Все обработки опрыскчванием были 5,5 х 10 спор на 0,5 литра9воды, в которую добавлялось 0,01 % жидкого детергента в качестве распыливающего вещества, Опрыскивания производились с помошью содового опрыскивателя тромбонового типа, калиброванного для подачи 113.55 л состава 0,405 га,Ряды обрабатывались опрыскиванием11,18 и 25 августа и 2 сентября и 8 сентября.5 15 сентября производились оценкиповрежденной листвы и количества насекомых. Давление насекомых из-за естественно происходящего нашествия совки капустной и импортированных мермитидов 10 было умеренным. Оценки повреждения листвы индексировались следующим образом:1) 0-3 % повреждения - случайные отверстия на листьях;2) 4-10 % повреждения - несколько ли стьев с отверстиями;3) 11-25повреждения -среднее/умеренное число листьев с отверстиями;4) 26-50 повреждения - большинстволистьев с отверстиями; и20 5) 51-100 Оповреждения - повреждение корневой шейки и/ипи все листья с отверстиями.Дэнные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значения 25 определялись с помощью испытания множественного ряда Дункана(ОНЯТ) при Р,05 уровня (Дункан 1951). Результаты сведены в таблице.Таблица ясно показывает 10-кратное 30 увеличение инсекционной активности инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента МВВ 8-И 196 по сравнению с коммерческим продуктом "Дипел".Такое увеличение было хорошо проде монстрировано, когда после обработки "Дипелом" уровень повреждений составлял менее чем 10 %, что соответствовало обра, ботке МВВ 8-18196 при разбавлении 1:10.Понятно, что модификации и изменения мо гут быть внесены в вышеприведенное описание без отклонения от идеи и объемаизобретения Формула изобретения45 Штамм бактерий Васцэ Эцг 1 пдепз 1 зайаг. Кцгэта ИВВ 1 8-18196 для полученияинсектицидного препарата,2,26 ее 0,75 авс 2,25 е3,0 е 4.0 4.50 4.75 1, Любые два числа в одной и той же колонке с последующей той же буквой значительноотличаются (Р = 0,05) ОМЯТ2. Распыление производилось 11,18,25 августа и 2,8 сентября.3. Вредпричиненный, главнь 1 м образом, совкой капустной и импортированными мермидами,4 ДИПЕЛ = 7,26 миллиардов международных единиц на 373,2 ч.5 Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц н 373,2 ч,Составитель А.Ульянова актор В,Трубченко Техред М.Моргентал Корректор И,Шмаковааз 2874 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат. "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 10ПИДРИН 2,4 ЕС 78.372 г активного ингредиента"ДИПЕЛЬ" 377 ч 4 1/10 В - 18195 Необрабатываемая конт ольная г я каСреднее количество совки капустной на 10 растений, 15 сентяб я Среднее количество мермитид импортированных на 10 растений, 15 сентября