Штамм бактерий bacillus тнuringiеnsis var кursтакi для получения инсектицидного препарата

(21 (86 (22 (46 (31 (32 (33 (71 ста ти 56 Изобретениеектицидной ый штамм В таЮ чВВ 1 В редиента. Инсектицидн для борьбы с уекрылых, в овка ни), "сов АЕ "импорти то та Кц ин етс Че т 1) цтоизбо кр пе на О УДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕ ОМСТВО СССРГО ПАТЕНТ СССР) 4742274/13РСТ/ОЯ 88/01560 (11.05.88)13,10.8930,08,93 Бюл. М 3205045018,05.87ОЯСоединенные Штаты Америки, преленные Министром торговли (ОЯ)Рассел С,Трейверз и Филлис А.В. Ма) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАСО ВИО 1 ЕИЯ 13 ЧАЯ, КОКЯТАК 1 ДЛЯ ПО касается получения новои композиции, содержащей ас 1 цз т)цгпд 1 епз 1 з чаг, 8197 в качестве активного ая композиция использувидами насекомых отряда частности, ТВ 1 СНОР 1 ОЙА ка капустная" и АВТООЕ 1 А рованные мермитиды". Спорообразующий микроорганизм В.1 пд 1 епзз был изолирован свыше 80 лет у назад, и с тех пор стал коммерчески естным в отношении биологической ьбы с вредителями. Спорообразующие ки В. 1)цг 1 пд 1 епз 1 з каждая продуцирует ру(эндоспору) и ромбовидный белковый сталл (параспору или клеточное включе). Энфомоцидные свойства приписывая исключительно б-эндотоксину, рый является основным компонентом аспорального кристалла, Когда кристалл еходит в растворимое состояние в кишке екомого, он вызывает образование проЛУЧЕНИЯ ИНСЕКТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА(57) Использование: производство инсектицидных препаратов. Сущность изобретения: штамм бактерий Васцз 1)цгпд 1 епз 1 з наг. КцгзтаИ выделен из окружающей среды, Депонирован в Северном Региональном Исследовательском центре департамента сельского хозяйства США, Пеория Иллинойс, под М МЯВ 1 В. Штамм обладает ауксотрофностью, требующей аминокислотный комплекс лейцина и валина для роста, споруляции и продуцирования кристаллов.1 табл. ксина, которыи активизируется в результе протеолитического расщепления,Являясь довольно специфическим видом в отношении Чешуекрылых насекомых и некоторых мух и москитов, В, Фцг 1 пд 1 епз 1 з является безвредной к невосприимчивым отрядам насекомых, животных и человека. В настоящее время в США В, 11)цг 1 пд 1 епз 1 з ф разновидности Кцгз 1 аИ включает в себя ин сектицидные продукты В. Фцг 1 п 91 епз 1 з наи- (,Д более широко используемые для борьбы с этими вредителями. Однако по отношению к этим продуктам отсутствует эффективный контроль на экономических уровнях применения.С другой стороны, синтетические пиретроиды являются химическими инсектицидными агентами, наиболее широко (ь) используемыми для борьбы с Чешуекрылыми вредителями. Пиретроиды являются высокоэффективными и обеспечивают более сильные средства борьбы с вредителями по сравнению и с используемыми в настоящее время инсектицидными продуктами В. йцг 1 п 91 епзз, Однако недостаток, связан 183777211 ый с использованием пиретроидов, состо1 1 в сОГ 1, ч 10 051 и являюгся токсичными вотг 1 ошсццс 1 не подлежащих уцичгожециюбссг 1;з:.Оночцыу, сем самым представляяо 11 дсцосгь для окружа 1 ощей водной жизни,озсому сущсствует потребноСть в эффек-тивцых 11 цсекгицидах, активных против Чешуекрылых, которые безопасны дляОкружающей среды, эффективны по стоимости и которые дублиру 1 от эффективностисинтетических пиретроидов.Цель изобретения состоит в получе 1 ииновой инсектицидцой композиции, содержащей новый штамм В. Йцгп 9 епзз чаг,КцгзсасРс Вв качестве активногоццг гадив 1 гд, которыЙ может быть использова 11 для борьбы в частности с Тгс 1 орцзаг: и Аз 1 осОд гард с насекомыми отрядаЧешуекрыль 1 х.оеый штамм В. 11 цгп 9 епзз ЙЯЙ В 18197 бьц 1 депо 1 ировац в Северном Региональном Исследовательском центре"депаргдмецта сельского хозяйства США,Гес 1 р 51 я, Иллинойс 61604,Новый шсд;ц 1 является спорогенцым,1 срс 1 сгаллсдбразу 1 сицим мутацтцым штаммомс 1 ыделе 111 ь 1 х иэ окружающей среды В,йцг 11 сс па з и имеет способность продуцировд; ь бипигдмиддль 11 ые кристаллы, состоящие из токсичного белка, и являетсяуникальным в том отношении, что обладаетауксо с рс 1 сьц Ос; гь 1 О, требующей аминокислотц;1 й комплекс лейцица и валина для роста,си О 1 л я 11 11 1 продуцировэ 11 ия кристаллов,Б прсггивацоложцосгь зтол 1 у ранее наблюдаемые шгдммы В, с 1 цгп 9 епзз проявлялидуксотроф,1 Ость,ца затрагивающую потребность в ами 11 окислогах :,Я,Мссегоп ег а.,Арр. Мсп:дс 1 ицу, 28, 14;24 - 128, 1974,,Цля целой изобретецич термин "ауксотрофцосгь" здесь Озцд 1 аег по 1 ребность в питатоГ 1 ЬЦЬ 1 ч ЮЕЩС гВДХ С СОЬХОДИМЬ 1 Х ДЛ 51рос 1 а, споруляции и продуцирования кристаллов микроорганизма.Фраза "аминокислотный комплекс питательной среды" употребляется здесь дляобозначения питательцой среды, содержащей колсби 11 аци 1 с; двух или более аминокисЛОГ,Новый штамм МсИ Вразмножец из почвенного слоя с использованиемцекг 1 дссическосо способа отбора посредством ацетата натрия и гепла. В соответствиис згим способом водная питательная средабуферизус;гс;я прил 1 ерно до 0,25 М ацетатомнатрия, чгобь 1 допустить размножение только цежсд, ,льцьх спорообразующих организмов, присутствующих в образцеокру:1 сак 11 цего поч е 11 ного слоя. Затем выращенные спорообразующие организмы и цеспорообразующие организмы в образце убивали пугем тепловой обработки. Выжившие споры после этого высеивались на чашки и выращивались на соответствующей 5 агаровой питательной среде для получениянового штамма согласно изобретению. Не прибегая к какой-либо конкретной теории, предполагается, что новый штамм согласно изобретения образу 1 отся во время процесса "0 отбора в результате мутагенеза природныхштаммов В, йцгп 9 епзз с последующей обработкой ацетатом натрия и теплом,Примером способа селекции являетсяследующий: 0,5 гэамма почвы было добав лена в 10 мл :бульона (100 мл воды, 1 гтриптона, 0,5 г экстракта дрожжей, 0,5 г хлористого натрия) в 125 мл.дефлекторной колбе,-бульон был буфериэован до 0,25 М ацетатом натрия. Смесь встряхивалась в те чецие 4 часов при 250 об./мин. и 30 С. После использования проточного теплового устройства пастеризации смесь нагревалась при 80 С в течение 3 минут. Термообработаццая смесь высеивалась на чашки с -агарол (-бульон, отвержденный с помощью 1,50/, агара) и инкубировалась в течение ночи (16 часов) при 30 С.Штамм МЯЛ Вимеет следующиехарактеристики: колос 1 ии явля 1 отся круглы ми, цельными, выпуклыми и кремового цвета с диаметром колонии 2 - 7 мм на питательном агаре после 24 часов. Вегетативные клетки являются аэробными, грэм- положительными, подвижными палочками 35 размеров 1-1,2 мкм ца 3-5 мкм, Концевые(верхушечные) споры вегетативных клеток це раздувают спорангий и составляют от 33 до 50% вегетативных палочек. Клетки являются положительными по катализе фермен та гл 1 окоэы гидролизу казеина, но вопрекитаксоцомическому описанию прежде наблюдаемых штаммов В, г 1 цгп 9 епз 3, штамм согласно изобретению не использует цитраты. Новый штамм не ферментирует 45 мдннит, арабиноэу и кислозу.Дополнительно штамм МсБ В гидролизовал крахмал, использовал эскулин, продуцировал лецитицазу и ферментировал салицин; клетки не продуцировали 50 уреазу и не ферментировали маннозу илисахарозу. Штамм является стойким по отношению к антибиотикам пеницилинового типа, к таким как нафициллин и метициллин, и является стойким по отношению к низким 55 уровням, т.е. около 10 г/мл, неомицина, канамицина и бромида э 1 ида, Как сказано выше, продуцирование спор и белковых кристаллов В, йцгпцепзз КВВ Втребует водной питатеЛьной среды, которая содержит лейциц-валиновый аминокислот 1837772ны комплекс. Для оптимального образова ия кристалла бактериями согласно из бретению предпочитаемый состав специ ьной питательной среды следующий: 0,3 триптона, 0,2% триптозы, 0,45% дрож же ого экстракта, полученного из буфера фо фата натрия 0,01 М при рН 6,8 с добавле ием 10 М 9304 и 10 Мп 304 после об аботки в автоклаве. Примером предпоч-тит льной среды роста является среда ТЗ, содержащая следующие ингредиенты: 0,3% тр тона, 0,2% триптозы, 0,15% дрожжевого кстракта (или 0,65% пептона Вас 1 Пцз), 10 1 М натрий фосфатного буфера с рН = -6 0,01% 1 М сульфата магния и 0,001% 1 15 М льфата марганца. Продуцирование клеток производится в аэрббных условиях при лю ой температуре, удовлетворительной дл роста микробов. Согласно изобретени, т.е. примерно от 10 С до 40 С; предпо чи аемый диапазон температуры между 27 С и 32 С, Величина рН питательной среды соответствующей для выращивания ку ьтуры В. Энг 1 пд 1 епз 1 з близка к нейтрально ти, т,е. рН от 6,7 до 7,2. Время инкубации 25 яв яется временем необходимым для полно о освобождения спор и кристалла и пр дпочтительно составляет от 18 до 24 часо, Клетки могут выращиваться в любой де лекторной встряхиваемой колбе в тече ни небольших опытов. Для операций в боле крупных масштабах удобно выращивать ку ьтуру в резервуаре, применяя помешива ие и аэрацию в отношении инокулирова ной жидкой питательной среды. После 35 ин убации клетки собираются традицион ым способом седиментации, как, напр мер, центрифугированием или фи ьтрованием, Клетки могут использо. ва ься как таковые или в замороженном ви де я последующего использования, Штамм вы ерживают при 30 С и 250 об /мин в 2 х ли ровых конических колбах Эрленместера с т ойными перегородками при объеме 25%анят при температуре 25 ОС нэ среде ТЗ, 45 т ержденной 1,5% агаром.Чтобы получить инсектицидную компози ию с В, йог 1 п 91 епз 1 з чаг. КогзтаЫ ЯВИ. В в качестве активного ингредиента ш амм, составляющий.до 30% общего объ ем смешивают с инертными ингредиентае а ю оставшийся объемрр н и ингредиент может быть разбавителем, ка например, вода. Другие инертные инг р иенты представляют консерванты, агент регулирующие текучесть, агенты, с собствующие прилипанию, спредеры, э льгаторы, поверхностно-активные вещ ствэ, экстендеры и буфер. Используемый и о 0 интервал доз для штамма составляет от 1,1 х 10 до 5 х 10 спор на 0,405 га. Инсектицид, содержащий мутант В,йог 1 п 9 епз 1 з МВВ 1 Вв качестве активного ингредиента в укаэанных дозах, является высокоэффективным в уничтожении насекомых отряда Чешуекрылых, в частности совки капустной и импортированными мермитидами (см. таблицу).Пример способа получения инсектицидной композиции включает смешение - через воздушное измельчение для обеспечения частиц определенного размера и гомогенности - штамма 1 чВЯ 1 В, составляющего до 30% общего объема, с инертными ингредиентами, которые составляют оставшийся обьем. Эти инертные ингредиенты включают консервант, 2 поверхностно активных вещества, агент, регулирующий текучесть, разбэвитель и буфер, Смесь затем гранулируется и упаковывается в герметичные и влагонепроницаемые контитперы. Инсектицидные композиции могут распыляться с использованием соответствующих методов распыления и устройств. Новый инсектицид также может быть инкапусилирован или заключен в соответствующий инкапсулирующий материал, такой как органический полимер, и применяться в порошковой форме. Также предусматривается, что генетический материал для дельтаэндотоксина нового штамма В. Йцг 1 п 91 епз 1 з ИВВ 1 Вможет переноситься с помощью техники рекам бинантных ДН К в другие бактерии и растения для обеспечения усиленной борьбы против вредителей, Изобретение иллюстрируется следующим примером.П р и м е р, В полевых испытаниях эффективность инсектицида, содержащего в качестве активного ингредиента ЙВВ 1. В, в отношении совки капустной и импортированных мермитидов сравнивалась с эффективностью синтетического инсектицидного продукта, содержащего пиретроид "ПИДРИН" ("Рус 1 г 1 п") и инсектицидный продукт В, йиг 1 п 91 епз 1 з разновидности Курстаки "ДИПЕЛЬ" ("01 ре 1"). "ПИДРИН" является товарным знаком продукта, продаваемого фирмой "Шелл корпорейшен", и содержит 30% циано (3-феноксифенил)метил-хлор- альфа(1-метил)бенэолацетата и 70% инертный ингредиентов. "ДИПЕЛЬ" являетсяоварным знаком продукта, продаваемого.фирмой "Абботт лабораториз" и содержит 3,2% В. Фцг 1 пд 1 епз 1 з разновидности Курста ки и 98,8% инертных ингредиентов. Также испытывались две других инсектицидных композиции, содержащих в качестве активных ингредиентов В. йцг 1 п 9 епз 1 зСреднее количество мермитид импортированных на 10 растений, 15 сентяб яСреднее количество совки капустной на 10 растений, 15 сентяб я ПИДРИН 2,4 ЕС 78,372 г активного ингредиента В. Фогпцепзз В50,0 а 1,00 а 1,25 а 0,0 а 1,0 аЬс 0,50 аЬс чаг, Когмай ИВВ Ви В, акогпцепзз чаг, аоггзоп ИВВ В. Инсектициды, содержащие в качестве активных ингредиентов новые штаммы МВВ В, В и В, содержали 5,5 х 10 спор на 0,5 л воды, 0,01 общего объема составлял жидкий детергент (добавленный как спредер) и остальной объем составляла вода.На Восточном Берегу Мэриленда капуста листовая была прямо высажена семенами в 4-рядных делянках по 30,48 см длины 07 июля 1986 г, Растения отстояли друг от друга на 5 см в ряду и 91,5 см между рядами. Обработки были организованы по схеме рандомизированных блоков с 4 повторами. Каждый ряд был буферизован защитным рядом, Почва была супесчаной почвой Норфолк "А". Все обработки опрыскиванием включали 5,5 10 спор в 0,5 литров воды, вЯкоторую добавлялось 0,01% жидкого детергента в качестве распыливающего вещества (спредера), Опрыскивания производились с помощью садового опрыскивателя тромбонового типа, калиброванного для подачи 113,55 л состава на 0,405 га,Ряды обрабатывались опрыскиванием11, 18 и 25 августа и 2 сентября и 8 сентября.15 сентября производились оценки поврежденной листвы и количества насекомых. Повреждения вследствие естественно происходящего нашествия совки капустной и импортированных мермитидов было умеренным; Оценки повреждения листвы были в диапазоне от 15 и индексировались следующим образом; (1) 0-3 повреждения - случайные отверстия на листьях; (2) 4- 100 повреждения - несколько листьев с отверстиями;(3) 11 - 25 повреждения - среднее/умеренное число листьев с отверстиями; (4) 26-50% повреждения - большинство листьев с отверстиями; и (5) 51-100% повреждения - повреждение корневой шейки и/или все листья с отверстиями. Данные анализировались методом дисперсионного анализа, и средние значениявыделялись с помощью испытания множественного ряда Дункана (ОМВТ) при Р = 0,055 уровня (Дункан 1951). Результаты приведены в таблице ниже.Таблица ясно показывает отличные инсектицидные свойства нового штамма согласно изобретению в отношении совки10 капустной и импортированных мермитидов.Штамм В, йогпцепзз Вобеспечилстатистически ту же защиту капусты листовой, как и "ПИДРИН", Инсектицидные композиции, содержащие штаммы ЙВВ15 Ви ИВВ В, в качестве активных ингредиентов, показывающие идентичные уровни защиты от совки капустной иимпортированных мермитид в выражениисреднего повреждения листьев, являются20 статистически менее эффективными, чем"ПИДРИН". Однако эти инсектициды обеспечивают 10-кратное увеличение активности по сравнению с промышленныминсектицидом В. Йогпдепзз "ДИПЕЛЪ".25 Такое увеличение хорошо демонстрировалось, когда обработки веществом "ДИПЕЛЬ" показывали идентичный уровеньборьбы (повреждение менее 100 ), как иштамм Впри разбавлении 1:10 пер 30 воначального состава.(1) Любые два числа в одной и той жеколонке с последующей той же буквой значительно не отличаются (Р = 0,05) ОМВТ,(4) ДИПЕЛ = 7,26 миллиардов междуна 40 родных единиц на 373,2 г.(5) Калибровано по выходу 7,26 миллиардов международных единиц на 33,2 г;Формула изобретенияШтамм бактерий Васоз тИогпдейзз45 чаг, Когзтай чВВ Вдля полученияинсектицидного препарата,10 1837772 Продолжение таблицы Составитель Г,Смирнова убченко Техред М.Моргентал Корректор; Заказ 2873 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10