Способ определения вируса табачной мозаики

(56),3,6 еп.Иго), 19 А.Х,Вахабов, Р.Ахмеджв77, у 34, Ь 2, р,475-483 ГО СУДА Р СТ В Е ННО Е ПАТЕ Н ТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ%19государственный универина, Институт микробио 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ57) Использование: в сельском хозяйстве ив иммунобио 1 ехнологии для диагностики Изобретение относится к иммунобиотехнологии, именно к способам диагностики растительных вирусов, и может быть использовано в сельском хозяйстве для выявления заболеваний растений и в научных исследованиях,Цель изобретения - повышение чувствительности способа и воэможности многократного использования носителя.Цель достигается тем, что в известном способе определения вируса табачной мозаики (ВТМ) путем нанесения антител на носитель, промывания, добавления ВТМ, коньюгированных с ферментом антител и субстрата с последующей регистрацией продуктов ферментативной реакции, в качестве носителя используют полиамидные плоские мембраны, обработанные 2 - 30- ным раствором глутарового диальдегида (ГА) или 0,4 - 1,20-ным раствором госсипола, в качестве фермента используют фосфолипаэу А 2, в качестве субстрата - яичный лецитин,растительных вирусов. Сущность изобретения: антитела связывают с носителем - плоскими полиамидными мембранами при помощи 2,0-3,00 ь-ного раствора глутарового диальдегида или 0,4 - 1,2-ного раствора госсипола, добавляют вирус табачной мозаики и антитела, меченные фосфолипазой А 2. В качестве субстрата используют яичный лецитин, регистрируют продукты ферментативной реакции потенциометрически, Способ позволяет повысить чувствительность анализа и многократно использовать носитель с иммобилизованными антителами, 2 табл. Существенные отличия заключаются в том, что в предлагаемом способе достигается ковалентное связывание антител с поверхностью активированной полиамидной микропористой мембраны с последующей адсорбционной иммобилиэацией вируса, а ф затем конъюгата тех же антител и ферментаОО за счет специфических иммунных связей и ф определения количества связанного вируса по продуктам ферментативной реакции, (Предлагаемое решение способствует обеспечению многократности использова- у ния носителя с иммобилизованными антитетелами и повышению чувствительности.П р и м е р 1. Полиамидную мембрану весом 9,6 мг заливают 1 мл 2,5 н.раствора ф соляной кислоты и инкубируют в течение 2 ч при температуре 45 С и перемешивания для активации поверхности носителя за счет ограниченного кислотного гидролиза, Избыток кислоты удаляют промыванием дистиллированной водой и 0,1 М боратным буфером, рН 9,0, К активированной поли30Мембраны с иммубилизованными антителами хранят в 0,1 М боратном буфере рН 9,0 или в высушенном состоянии в полиэтиленовых мешочках при температуре около 4 С. 35Перед использованием для ИФА мембрану трижды промывают 0,05 М трис-НС буфером с рН 7,5, содержащего 0,05 Твин э.Для осуществления ИФА к мембране с 40 иммобилизованными антителами приливают 0,5 мл 0,05 М трис-НС буфера, рН 7,5, содержащего 30 ммоль хлористого кальция и 5 , этиленгликоля (сорбирующий буфер) и 0,5 мл исследуемого на вирус образца, По сле инкубации 1 ч при 37 С мембрану промывают от несвязанного вируса и приливают 1 мл сорбирующего буфера, содержащего 5 - 10 мкг (по белку) конъюгата антител с фосфолипазой Аг и оставляют на 50 1 ч при 37 С и непрерывно перемешивают.Мембрану многократно отмывают от несвязанного конъюгатэ 0,05 М трис-НС буфером с рН 7,5, содержащем 0,10-ный тритон Х для полного удаления неспецифически 55 связанных белков.Определение фосфолипазной активности проводят методом потенциометрического титровэния при постоянном значении рН, испольэ,в титрометрическую установку амидной мембране добавляют 1 мл того же буфера, содержащего 0,1 мл 2,5-ного раствора ГА и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре для модификации функциональных групп носителя, Избыток ГА удаляют промыванием носителя 10-кратным количеством 0,05 М боратного буфера, рН 9,0. К модифицированному полиамиду приливают 1 мл 0,1 М бвратного буфера с рН 9,0, содержащего 35 мкг (по белку) антител, очищенных методом аффинной хроматографии из сыворотки кроликов, иммунизированных томатным штаммом вируса табачной мозаики, Инкубация идет в течение 48 ч при 4 С и непрерывном перемешивании. Несвязавшиеся антитела удаляют промыванием мембраны 0,05 М боратным буфером, рН 9,0 до исчезновения следов белка. К мембране с ковалентно иммобилизованными антителами добавляют 1мл 0,1 М боратного буфера рН 9,0, содержащего глицина (из расчета 0,35 г на 1 г носителя) и инкубируют в течение 2 ч для блокирования альдегидных групп, оставшихся после присоединения антител. Избыток глицина удаляют промыванием мембраны 5-кратным (по объему) количеством 0,05 М боратного буфера, рН 9,0 (4-5 раз); 5 10 1520251000 = А -мкмол Ч 0 - конечный объем щелочи, мл (израсходованной на тировэние продуктов реакции ферментов на мембране);М - начальный объем щелочи, мл (израсходованный на титрование субстрата);М - нормальность раствора щелочи в микромолях;1 - время, мин;и - масса навески мембраны, мг.Для определения активности исходной фосфолипазы А 2 или ее коньюгэтэ с антителами в реакционную смесь добавляют 0,05 - 0,2 мкг (по белку) фермента или 0,5 - 2,0 мкг конь ю гата. рН-стат Т - 108, состоящую из блока автоматического титрования (БАТ), блока сопряже-.ния (БС), электродной части, соединенной срН-метром, Для поддержания постояннойтемпературы используют водный ультратер-мостат,УТ - 15 с термостатированной отводной ячейкой, которую помещают намагнитную мешалку.Реакционную смесь наливают встеклянный стаканчик объемом 15 - 20мл мешают в ячейку, Общий объем субстратной смеси составляет 10 мл и содержит: 140 ммоль чаС 1, 10 ммоль СаС 2, 6ммоль тритона Х, 0,5 ммоль трис-НСбуфера с рН 8,5, 2,2 ммоль яичного лецитина, рН среды 8,5, температура 38 С.В смесь опускают электроды и капилляр для подачи титрующего раствора с помощью автобюретки, включает титратор и,доводя рН и температуру смеси до заданнойточки, производят контрольное титрованиесубстрата в течение 5 мин. После этого вячейку опускают мембрану - (массой 9 - 10мг) после проведения ИФА и снова в течение 5 мин оттитровывают образующиесякислотные продукты реакции, Титрующийраствор - 0,02 н,йаОН, Регистрацию изменения кислотности среды проводят на самописце во время или по показанию счетчикадозатора,Титрование выделившихся свободныхжирных кислот проводится автоматическипри постоянном значении рН,Активность фосфолипазы А 2 конъюгатана мембране по скорости гидролиза субстрата выражают в микромолях жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 гполиамидэ и вычисляют по формулеУдельная активность фермента иликоньюгатэ выражают в мкмолях свободныхжирных кислот, за 1 мин в расчете на 1 мгбелка.Чувствительность при определении активности фосфолипазы А 2 титрометрическим методом составляет 0,02 мкг (по белку)фермента или 1 ммоль/мин по продуктамреакции. Ошибка метода 5%,В данном примере на поверхности мембраны связалось 24,6 мкг(по белку) антител.При проведении ИФА на атой мембране вмодельных опытах с чистым препаратомТШ - ВТМ в количестве 3,0 нанограмм (нг) впробе скорость реакции коньюгата, связанного с вирусом, составляет 85,25ммоль/мин на 1 г носителя,После ИФА мембрану регенерируют путем промывания 0,05 М трис-йаОН буфером, рН 10,5 - 11,0 с добавлением 1 М КС и 200,015 М ЭДТА для удаления конъюгата ивируса с поверхности носителя с иммобилизованными антителами и после промывкивторично используют для ИФА ТШ - ВТМ,Результат после повторного использо. вания аналогичен данным первичного анализа, После 3-кратного пользованиявоспроизводимость результатов анализасоставляет 98%, кратного 4-кратного 95 о ,5-кратного 93 о , 6-кратного 90%. 30П р и м е р 2. Анализ осуществляютаналогично примеру 1. Для ковэлентногосвязывания антител с поверхностью носителя применяют 2,0%-ный раствор глутарового альдегида. 35Результаты анализа: на поверхностимембраны связалось 23,0 мкг (по белку)антител, скорость реакции при ИФА ТШ -ВТМ - 80,3 мкмоль/мин на 1 г носителя,П р и м е р 3. Анализ осуществляют 40аналогично примеру 1, Для ковалентногоприсоединения антител к носителю используют 3,0% ГАРезультаты анализа: на мембрану иммобилизовалось 22,8 мкг (по белку) антител, 45скорость реакции при ИФА ТШ-ВТМ - 78,1мкмоль/мин.Как видно из приведенных примеров,2,5 о -ный раствор ГА является оптимальным для иммобилизации антител на полиамидную мембрану.При увеличении концентрации ГА в инкубационной среде наблюдается уменьшение количества иммобилизованных антители соответственно занижение результатов 55ИФА, При уменьшении концентрации ГА всреде наблюдается такая же картина.Возможно, при использовании 2,5 ного раствора ГА на поверхности мембраныобразуются цепи длиной, отвечающей наиболее равномерному образованию пространственных структуру, что обеспечиваетоптимальные условия для проведения ИФАвируса табачной мозаики.П р и м е р 4, Анализ осуществляютаналогично примеру 1. Для ковалентногосвязывания антител с поверхностью мембраны используют 0,87 о-ный раствор госсипола.Результаты анализа: на мембрану иммобилизовалось 24,6 мкг (по белку) антител,скорость реакции при ИФА ТШ-ВТМ (3,0 нг)- 85,0 мкмоль/мин.П р и м е р 5. Анализ осуществляютаналогично примеру 1, Для ковалентногосвязывания антител с поверхностью мембраны используют 0,4 о -ный раствор госсипола,Результаты анализа: на мембрану связалось 15,3 мкг (по белку) антител, скоростьреакции и ри ИФА ТШ - ВТМ - 48,5мкмоль/мин.П р и м е р 6, Анализ осуществляютаналогично примеру 1. Для ковалентногосвязывания антител к поверхности мембраны используют 1,2 -ный раствор госсипола.Результаты анализа; на мембрану иммобилизовалось 24,5 мкг (по белку) антител,скорость реакции при ИФА ТШ - ВТМ - 85,0мкмоль/мин,В табл,1 представлены результаты исследования по определению зависимостискорости ферментативной реакции приИФА от массы мембраны и количества антител, иммобилизованных на ней.В целях зкономии антител и носителяцелесообразно использовать для иммобилизации антитела в количестве 15 - 35 мкг на9 - 10 мг носителя, Мембраны массой 3,3 мгможно использовать только для ИФА разбавленных растворов при содержании ТШ -ВТМ от 0,003-3,0 нг в определяемой пробе.При идентификации вируса выше этих количеств в пробе наблюдались искажения резул ьтато в.В табл,2 представлены результаты, изкоторых видно, что чувствительность со.ставляет 0,003-0,030 нг ВТМ в пробе,Данные приведенные втабл,2 полученыбез применения тритона Хдля промывочных операций. Использование 0,1-0,5%ного тритона Хдля промывки мембранснижает фон в 2 - 3 раза,Кроме того следует отметить, что имеющийся фон ниже по сравнению с адсорбционной иммобилизацией,Предлагаемый способ имеет следующее преимущества по сравнению с прототипом: увеличивается чувствительно1817025 15 Таблица 1 Влияние массы мембраны и количества антител на скорость ферментативной реакцииПри проведении ИФА напробе 3,0 нг. Прим ане, содержание ТШ в(0,003 нг - 0,030 нг ВТМ в пробе против 1,0 нг) и повышается точность анализа, возрастает кратность использования носителя, а также расширяются возможности методов идентификации продуктов ферментивной реакции; Формула изобретенияСпособ определения вируса табачной мозаики (ВТМ), включающий нанесение антител на носитель, промывание, добавление ВТМ, конъюгированных с ферментом антител и субстрата, с последующей регистрацией продуктов ферментативной реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа и 5 возможности мнОгократного использования носителя, в качестве носителя используют полиамидные плоские мембраны, образованные 2 - 3-ным раствором глутарового диальдегида или 0,4 - 1,2-ный рас твором госсипола и антителэми, в качествефермента используют фосфолипазу А 2, а вкачестве субстрата - яичный лецитин,10 1817025 Таблица 2 Данные ИФА с чистым препаратом вируса табачной мозаики П р и м е ч а н и е, Количество иммобилизованных антител на мембрану массой 9,0 мг 15 мкг. Составитель А,ЗаитоваТехред М.Моргентал Корректор С.Лисина Редактор Т.Иванова Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 1720 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5