Способ получения эритроцитарного диагностикума для определения ортомиксо-и арбовирусов

Нагруженные эритроциты дважды отмывают в 2-кратном объеме забуференного физиологического раствора рН 7,2 со стабилизатором (бычий сывороточный альбумин 0,1 ф-ной концентрации), Отмытые эритроциты суспендируют в вышеуказанном рас 1 воре до 0,5-ной взвеси. Затем по общепринятой методике ставят РНГА, используя панели микротитратора "Такачи", Панели оставляют при комнатной температуре (18-22 С) до оседания эритроцитов в контролях. Показано, что максимальное количество выявляемого антигена вирусов гриппа и арбовирусов в исследуемом материале достигается с эритроцитарными диагностикумами, приготовленными присенсибилизации в присутствии метола в 1,0 -ной концентрации, Использование 0,5 -ной и 1,5-ной концентрации приводило к снижению титра выявляемого анти- гена.Влияние концентрации метола на способ получения эритроцитарных диагностикумов отражено в табл. 1.П р и м е р 2. Влияние концентрации взвеси эритроцитов на эффективность их сенсибилизации при помощи метола,К трем порциям по 1,0 мл различной взвеси формалинизированных эритроцитов барана: 1,0 , 5,0 и 10,0 ф , добавляют 1,0 мл сенситина и 1,0 мл свежеприготовленного 1,0 -ного водного раствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53 С в течение 40 мин, периодически встряхивая, Затем также как в примере 1.Результаты, представленные в табл.2, показывают, что наибольшая чувствительность РНГА проявляется с диагностикумами, приготовленными на основе 5,0-ной взвеси эритроцитов, Взвесь эритроцитов 1,0 и 10-ной концентрации приводила к снижению показателей выявляемого вирусного антигена,Влияние концентрации взвеси эритроцитов на эффективность их сенсибилизации при помощи метола отражено в табл, 2.П р и м е р 3. Влияние температуры инкубации на эффективность сенсибилизации эритроцитов в присутствии метала.К трем порциям 1,0 мл 5,0 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана добавляют 1,0 мл сенситина, затем вносят 1,0 мл свежеприготовленного 1,0 -ного раствора метала, Смесь инкубируют в течение 40 мин при различных температурах - 45, 53 и 60 С, периодически встряхивая. Далее как в примере 1.Как свидетельствуют результаты, представленные в табл.3, сенсибилизации эритроцитов иммунными противовирусными препаратами имела место при всех испытанных режимах, однако наиболее высокиепоказатели РНГА получены при температуре инкубации 53 С.5 Влияние температуры инкубации на эффективность сенсибилизации эритроцитовв присутствии метола отражено в табл. 3,П р и м е р 4, Влияние продолжительности сенсибилизации на эффективность пол"0 учения диагностикумов,К трем порциям 1,0 мл 5,0-ной взвесиформалинизированных эритроцитов баранадобавляют 1,0 мл сенситина, затем - 1,0 млсвежеприготовленного 1,0 -ного водного15 раствора метола. Смесь инкубируют притемпературе 53 С в течение 30, 40 и 50 мин.Результаты, представленные в табл.4,свидетельствуют с незначительной разницевлияния экспозиции на чувствительность20 полученных диагностикумов, однако визуально наиболее четкое оседание эритроцитов в контролях получены присенсибилизации в течение 40 мин.Влияние продолжительности сенсиби 25 лизации на эффективность получения диагностикумов отражено в табл. 4.П р и м е р 5. Проверка специфичностиэритроцитарных диагностикумов, полученных по предлагаемому способу30 Эритроцитарные диагностикумы дляиндикации вирусов гриппа и арбовирусовготовили следующим способом; к 1,0 мл5,0 -ной взвеси формалинизированныхэритроцитов барана добавляют 1,0 мл сен 35 ситина (1 мг/мл белка), затем вносят 1,0 млсвежеприготовленного 1,0;-ного водногораствора метола. Смесь инкубируют в водяной бане при температуре 53 С в течение40 мин, периодически встряхивая. Нагру 40 женные эритроциты дважды отмывают в2-кратном объеме забуференйого физиологического раствора рН 7,2 со стабилизатором (бычий сывороточный альбумин0,1-ной концентрации). Отмытые эритро 45 циты суспендируют в вышеуказанном растворе до 0,5-ной взвеси, Затем пообщепринятой методике ставят РНГА,Указанным примером в табл.5 доказанаспецифичность эритроцитарных диагности 50 кумов, приготовленных по предлагаемомуспособу, Эритроцитарные диагностикумывзаимодействовали только с гомологичными вирусными антигенами и не реагировалис гетерологичными.55Специфичность эритроцитарных диагностикумов, приготовленных предлагаемым способом отражена в табл. 5,П р и м е р б. Проверка эффективности и преимущества предлагаемого способа получения эритроцитарных диагностикумов.1817026 45 Таблица 1 Вируссодержащий материал Титр РНГА с эритроцитарными диагностикумами, приготовленными с помощью метола в кон ент ации,0,5 1,0 1,5 А/Миссисипи/1/85 (НЗИ 2)А/Тайвань/1/86/ (НМ 1)В/Энн Арбор/1/86Клещевой энцефалит (КЭ)Крымская геморрагическаялихо адка КГЛ 112+ 2,4 56+ 0,8 13,1 + 0,1 158+ 0,5 2048 х 6,4 2048 + 6,4 958+ 4,5 1670+ 5,5 30,0+ 0,6 30,0+ 0,6 240+ 0,4 39+ 0,4 208+ 1,3 1100+ 6,0 239+ 0,2 П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл, 1 - 6 титры антигенов приведены в обратных величинах среднегеометрических титров. Эритроцитарные диагностикумы готовили по известному и предложенным методами,1. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана сенситином по известному методу с помощью амидола,Смешивают осадок от 0,4 мл 20 -ной взвеси формалинизированных эритроцитов барана с 0,2 мл раствора сенситина и с 0,2 млсвежеприготовленного 0,4 -ного водного 10раствора амидола, Смесь инкубируют в течение 30 мин при 53 С с периодическимвстряхиванием.2. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана сенситином по 15предлагаемому методу, Смешивают 1,0 мл5 -ной взвеси формалинизированныхэритроцитов барана с 1,0 мл сенситина и 1,0мл свежеприготовленного 5,0 -ного водно-,го раствора метола, Смесь инкубируют в 20течение 40 мин при 53 С периодическим.встряхиванием.Результаты сравнительной индикациивирусного антигена с диагностикумами,приготовленным по известному и предлагаемому методу, показали значительноепреимущество в чувствительности предлагаемого способа и воэможности широкогоприменения метода в отличие от известного, ограничение которого связано со снятием с производства амидола.В табл.6 показана высокая эффективность (в 6 - 8 раз) эритроцитарныхдиагностикумов, приготовленных по предлагаемому методу, в сравнении с известным 35(с помощью амидола).Сравнительная оценка чувствительности эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по известному способу ипредлагаемому способу, дана в табл, 6, 40П р и м е р 7. Результаты практическогоприменения эритроцитарных диагностикумов, приготовленных по предлагаемомуспособу. Эритроцитарные диагностикумы, приготовленные по предлагаемому способу, были испытаны при исследовании проб клещей,доставленных работниками Обл.СЭС из природных очагов крымской геморрагической лихорадки, расположенных на территории Казахстана.Результаты обнаружения антигена вируса крымской геморрагической лихорадки с помощью эритроцитарных диагностикумов, представленные в табл.7, показали явное преимущество применения препаратов, приготовленных по предлагаемому способу.Выявление вирусного антигена с помощью эритроцитарных диагностикумов, приготовленных различными методами, дано в табл. 7.Помнениюспециалистов головных СЭС предлагаемые эритроцитарные диагностикумы высоко чувствительны и специфичны, Реакция с указанными препаратами легко воспроизводима и может быть применена в условиях быстрого развертывания лаборатории в полевых условиях.Таким образом, преимущество предлагаемого способа получения эритроцитарных диагностикумов заключается в высокой их чувствительности при экономичности, простоте и воспроизводимости методики, что позволяет широко использовать указанный способ в практических учреждениях медицинского и ветеринарного профиля,Формула изобретения Способ получения эритроцитарного диагностикума для определения ортомиксо- и арбовирусов путем сенсибилизации эритроцитов специфическими антителами в присутствии конъюгирующего агента, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, используют в качестве коньюгата 1,0 -ный водный раствор метола.при ГКНТ ССС Производств каз 1720 ВНИИПИ Госуд Тираж Подписноественного комитета по изобретениям и открыти 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 здательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 1