Штамм бактерий bacillus acidocaldarius, используемый для силосования соломы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК АЗ 179939 СА ЕНИ БРЕ И ПАТЕНТУ лог евская, Р.Ш А.Н. Илялет ологи СССР 983.ВАСШЗЯ ЗУЕМЫЙ ДЛЯ логия и может зводстве био ой в качестве ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Институт микробиологии иАН КазССР(73) Институт микробиологии иАН КазССР(54) ШТАММ БАКТЕРИЙАСООСА ОАВ 05, ИСПОЛЬСИЛОСОВАНИЯ СОЛОМЫ(57) Использование; биотехнобыть использовано при проимассы бактерий, используем Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в кормопроизводстве для микробной конверсии соломы или других целлюлозосодержащих субстратов с целью получения корма с повышенными по сравнению с исходным сырьем поедаемостью и питательностью,Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, ассимилирующих целлюлозу.Это достигается применением ВасЮцз асдосадагоз 17 - штамма, отличающегося от штамма-прототипа С.Лач 1 депа более высокой популяционной устойчивостью и технологичностью, что способствует снижению затрат и получению стабильных результатов как при производстве закваски, так и при биоконверсии субстрата, осуществляемой по методу силосования, Преимуществом 5 С 12 й 9/42, 1/20, А 23 К 3/00 закваски для биоконверсии (силосования) соломы. Сущность изобретения: полученный штамм бактерий Васцз асдосадагаз (17), ВКПМ Вотличается высокими показателями скорости роста, интенсивностью накопления биомассы иферментной активностью, а также популяционной устойчивостью, обусловливающей его технологичность. Ацидо- и термотолерантность В,асдосадаг цз 17 обеспечиваеттакже его конкурентоспособностьи высокую активность в процессе анаэробной ферментации соломы. Использование В,асдосадагОз 17 в смешанной культуре со Ятгерсососсцз ассз дазтатсиз способствует углублению процесса расщепления целлюлозы, повышению сохраняемости корма и повышению эффективности ферментации соломы. 3 табл. предлагаемого штамма перед ранее известным является отсутствие полиморфности и популя ционная устойчивость. СпособностьВ.асдосадаг 1 цз 17 к спорообразованию, его термоустойчивость и ацидотолерантность обеспечивает более высокую выживаемость в экстремальных условиях, в частности при приготовлении сухих препаратов методом распылительной или лиофильной сушки, а также в процессе созревания силоса, когда температура силосуемой массы возрастет до 60 фС и выше. Эта температура в сочетании с кислыми значениями рН среды вызь 1- вает гибель штамма-прототипа и прекращение процесса расщепления целлюлозы, тогда как В,ас 1 досадагаз 11 в этих условиях остается жизнестойким и активным, В,асдосадагаз 17 отличается от С;1 ачдепа 22 значительно более высокимиты.6. На 0,001% лизоциме роста нет,7. На МПБ образуют щелочь.8. На 1-10% ИаО рост хороший. 559, На среде Сабуро рост хороший. Колония серого цвета с легким розовым оттенком,10. Рост на МПБ - пленка тонкая. Средапрозрачная. Осадок средний, рыхлый. показателями скорости роста, активностинакопления биомассы и экономического коэффициента, что снижает затраты на производство бактериальных заквасок.Высокая технологичность штаммаВ,асбосаЫагЬз, установленная в лабораторных опытах, в процессе наработки заквасок на опытно-промышленной установкеИнститута микробиологии и вирусологииАН республики Казахстан, а также в производственных исйытаниях показала перспективность его широкого; внедрения вкормопроизводстве, Этот штамм рекомендован для получения заквасок в условияхпромышленного производства. На Степногорской научной опытно-промышленной базе (СНОПБ ПО "Прогресс" ) отработанопытно-промышленный регламент получения его биомассы.Предлагаемый штамм бактерийВ,аси 1 осаЫагщз 17 имеет следующую морфологическую и физиологическую характеристику,Грамположительные бактерии относятся к температура- и кислотоустойчивым..Представляют собой палочки с закругленными койцами, размер 0,8 х 3,5 микрон; свозрастом они по форме приближаются ккоккам. Располагаются поодиночке, парами. и короткими цепочками, Концевые споры.Подвижны, факультативный аэроб,ферментативные свойства.а) сахаролитические:1. Расщепляют глюкозу, арабинозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу до кислоты. Присбраживании углеводов газы не образуют,2. Гидролизуют полисахариды; крахмал,декстрин и целлюлозу,3, Из спиртов гидролизуют маннит,дульцит нет,б) протеолитические:1. На МПБ аммиак образуют хорошо, аиндол и сероводород слабо,2, Желатину разжижают,3. Вызывают подщелочение и протеолиз молока.1. Ацетоин не образуют,2, Каталазу образуют,3, Тирозин не расщепляют,4. Казеин не гидролизуют.5. Нитраты восстанавливаются в нитри 11, Рост на РПА - поверхность мозговидная. Матовая (мучнистая), Бежево-серого цвета, Край колонии лопастной,Структура крупнозернистая, консистенция5 плотная, легко снимается с агара пленкой,не тянется за петлей(не слизистая). Способность эмульгироваться - взвесь в виде обрывок пленки.12. Желатина уколом, Светло-бежевый10 поверхностный рост, Разжижение послойное, очень медленное.Штамм синтезирует конститутивно комплекс целлюлаз, характерных для целлюлолитических бактерий. При концентрации15 10 бактериальных клеток в.1 мл среды:целлюлолитическая активность равна 7-9 мгрв/мл (на фильтровальной бумаге).Культуру хранят на скошенном суслоагаре или 0,7% соломенном агаре при 5 С,20 пересев необходим через два месяца, Длякультивирования штамма применяют жидкую среду следующего состава, гл:МаМОз20К 2 НРО 4 1,025 Мд 304 . 0 3.ИаС 1 . 10Дрожжевой автолизат 1,0Глюкоза или крахмал 10 гКультивирование 24 ч 30 - 35 С, рН - 6 - 7,30 Штамм выделен из прелой соломы путем пересевов на среду с соломенным агаром. Способен развиваться на соломе ванаэробных условиях при значениях рН силоса 3,8;4,7,35 Для углубления процесса бактериальной конверсии целлюлозы В.асбосадаггоз 17 (ЦЛ Б) используется в смеша н ной кул ьтуре со Ятгертососсиз асся спазсассцз (АМС), 40 который ассимилирует продукты метабо- .лизмацеллюлолитических бактерий, устраняя явление катаболитной репрессии и стимулирует его рост какими-то (неидентифицированными) продуктами своего мета болизма, не оказывая антагонистическоговоздействия. Наличие у этих микроорганизмов предпосылок к симбиотическому сосуществованию позволяет выращивать их биомассу, используемую для приготовления 50 заквасок в одной ферментации, что повышает его экономическую эффективность.П р и м е р 1, Предложенный намиштамм. целлюлолитических бактерий В.асбоса 1 багйз 17 и штамм-прототип СеИоотопаз Лач 1 депа 22 выращивали в лабораторном ферментере с рабочим обьемом 2 л на видоизмененной среде Гетчинсона (г/л): ГчайОЗ 2,0; К 2 НРО 4 1.0; Мд 504 0,3; МаС 3 1,0; дрожжевой автолизаг 1.0; глюкозаполученных образцах силоса показало, что при использовании предложенного штамма .бактерий В.асЫоса 1 баг 1 дз 17 процесс деструкции их происходит глубже. Так, содержание целлюлозы снизилось на 10 О, тогда как в случае С.йач 9 епа на 8,5%.Поскольку гидролиз трудногидролизуемых полисахаридов осуществляется с помощью ЦЛБ, способствуя улучшению 55 10 г. Культивирование осуществляли с перемешиванием при 32 С, рН - 6-7.Удельная скорость ростаВ.ас 1 госа 1 баг 1 цз составила 0,42 ч-1С.Лач 19 епа - 0,10 ч . Стационарная фаза 5роста у первого штамма наблюдается через17 ч культивирования, максимальный синтез ферментов целлюлозного комплекса -через 24 ч. Количество биомассы составила4,1 г/л, экономический коэффициент переработки субстрата 0,51, продуктивность1,72 г/л в час, Время генерации 1 ч 39 мин,Время культивирования СЛ 1 ач 19 епа доначала стационарной фазы составляет 6 ч,накопление биомассы 3,6 г/л, экономический коэфф. циент переработки субстрата0,40, продуктивность 0,36 г/л в час, времягенерации 6 ч 56 мин.С помощью того и другого штаммов целлюлолитических бактерий была проведена 20твердофаэная ферментация пшеничной соломы,Соломуизмельчают до размера 3-10 см,Применяется обычная технология силосования кормов. Осуществляется послойное увлажнение соломы. водным раствором довлажности ее 65%. Раствор равномернораэбрызгивается по всей поверхности силосуемой массы из цистерны с помощью насоса.через шланг с распылителем на конце, 30Рабочий раствор состоит из закваски ЦЛ Б иАМС (1:) из расчета 3 г сухого препарататитр 10 клеток в мл на 1 т соломы в 1,0%пова рен ной соли. После тщател ьн ой трам. бовки трактором, траншея герметически за. крывается пленкой,Анализ полученного продукта проводили через 30 дней. Органолептические показатели того и другого силоса хорошие, Прииспользовании В.асгосагаг 1 цз 17 силос 40имеет запах хлебной опары, при силосовании С,йач 19 епа 22 - квашенных овощей, рНв том и другом случае 4,3 - 4,4, сумма органических кислот 1,6 г/кг, Таким образом, можно сделать вывод о том, что 45органолептические показатели, определяющие поедаемость силоса при использовании различных целлюлолитическихбактерий практически не различаются, Определение количества трудногидролизуемых полисахаридов (целлюлозы) в перевяримости корма, следует признать преимущество заявляемого штамма над штаммом-прототипом.П р и м е р 2, Как показали наши ранее приведенные исследования, благоприятное влияние на развитие С.йач 19 епа 22 оказывает штамм молочнокислых бактерий 1.регяоасет 1 соа В(б)-23, Рост В,асЫосаЫагаэ 17 стимулируется другим штаммом молочно- кислых бактерий Ятг. 1 аст 1 з сазтат 1 соз. проведена твердофазная ферментация пшеничной соломы с использованием отобранных смешанных культур целлюлолитических и молочнокисгых бактерий,Культуры были выращены в лабораторных условиях (см, пример 1) и перед применением целлюлолитические бактерии смешаны с молочнокислыми в соотношении 1 1.Полученные результаты показали, что при применении смешанных культур целлюлолитических и молочнокислых бактерий в том и другом варианте для силосования соломы полученный продукт незначительно отличается от силоса, приготовленного с заквасками из монокультур целлюлолитических бактерий, 8 нем определяется лишь немного больше молочной кислоты (на 0,1-.0,2 оь в зависимости от варианта опыта) и несколько меньшее количество связанной масляной кислоты, По-видимому, при использовании монокультуры целлюлолитических бактерий органические кислоты продуцируются представителями спонтанной молочнокислой флоры в изобилии встречающейся в доброкачественной соломе. Для подтверждения этого предположения в следующей серии опытов силосовали пшеничную солому, предварительно подвергнутую щелочной предобработке, которая с одной стороны способствует делигнификации ее, а с другой убивает спонтанную микрофлору (табл.2), Полученные данные показали, что использование в этом случае монокультуры целлюлолитических бактерий приводит.к получению продукта с отрицательными органолептическими показателями (неприятный запах и вкус), который не поедается животными. Кроме того, в щелочных условиях при этом возможно разв:тие гнилостной микрофлоры. Показано, что для получения полноценного продукта из предобработанной щелочью соломы необходимо введение в состав закваски молочнокислых бактерий, В результате их развития накапливаются молочная и уксусная кислоты, снижающие рН среды и обеспечивающие консервируемость продукта, а также улучшающие органолептические показатели,1799395 через 24 ч культивирования, При рН 6.0 и температуре 50 С активность эндоклюкэнэзы (КМЦэзы) достигается 140 мг РВ/мл, эктивность нэ фильтровэльной бумаге(АФБ) - 9 мг РВ/мл, целлобиэзы - 3 мг глюк/мл,Полученные в промышленных ферментерэх(СНОПБ ПО "Прогресс" ) опытные пэртии, закваски (сухэя и пэстообрэзнэя) В.эсЫосэЫэгз (Кэльдэрин) имеет следующую характеристику Приведенные результаты позволяют сделать заключение о том, что для обеспечения нужной направленности процесса в случэе испальзовэния для биоконверсии нестандартного сырья необходимо введение в 5 состав закваски помимо целлюлолитических также и молочнокислых бактерий,Приведенные ниже данные позволяют сделать заключение о преимуществе смешэнной культуры ЦЛБ и АМС, 10 Словообразование Через, 60 дней60-80 С Терноустойцивость рН-устойцивость Скорость роста Зкономицвскнй козффицмент переработки субстратаглюкоза0,51 крахмал 0,40 0,40 026 На-карбокснлметил- целлюлоза 0,21 0,32 Способность сбраюватьг пентозы (ксилозу и арабинозу) Сбранивают Не сбратввают Активность ферментовцеллюлозного изнплексл: знлоглюканаза (КИцаза) 30-4,0 ед/нл 140 нг Р 0/ л - 13,1 ед/мп на фильтровальнй бу- маге 9 иг РЗ/мл . 0,83 вд/мл 1 мг глюк,/мл - 0,28 ад/нл целгобиазаПзтреоность в факторахроста 6 нотин, тнамик Не нуидаетсх П р и м в р 3, Биомасса С.йэч(депэ Культура однородная, чистая, представ(прототип), выращенная нэ опытно-про- лена наличием грэмположительных паломышленнойустэновкеинститутэ,титрее 0,2 чек, в нэчэле стационарной фазы ростамлрд.кл/ г. Микроскопировэние и высевы 15 нэблюдэется появление единичных спор.культуры нэ питательные среды показало Целлюлолитическэя активность обнарувысокую полиморфность ее. Клетки пред- жена кэк при наличии в среде целлюлозосо стэвляют собой смесь кокков и пэлочек держащих источников углерода, тэк игрэмположительных и грэмотрицэтельных, 1 умоносэхэров. Конститутивныйтип ферменЦеллюлолитичеакую активность получен тэ у В,эсдосэ 6 эгоз позволяет в отличие отной биомассы трудно контролировать, т,к. прототипа получить активную биомассу нэдля проявления ее в составе среды необхо- любом утилизируемом субстрэте,димо иметь индуктор(источник целлюлозы), Таким обрэзом, предложенный штаммкоторый вызывает более низкую скорость целлюлолитических бактерийроста культуры, но обеспечивает синтез 25 В,эс)босэЫэг)ов 17 отличэется от известнокомплекса целлюлэз, По этой причине био- го более вь(сокой технологичностью, что помэссэСЛ(эччепэ,полученнэянэсредэх,со- зволяет успешно испольэовать его длядержащих в качестве источника углерода стабильного производства зэквэсок, обеслегкоусвояемые сахара зачастую имеют печивэющих высокое кэчество получаемогоочень низкую целлюлолитическую актив кормового продуктэ,ность или не имеют вообще. Формула изобретенияПри культивировании В.эсЫосэЫэгцз Штамм бактерий Вэс(з эсЫосэЫэгЫзнэ среде, описанной выше, максимальная ВКПМ В, используемый для силосовэцеллюлолитическэя активность отмечается ния соломы.Табл ица 1Сравнительная характеристика производственно"ценьыхсвойств предлагаемого штамма бактерий иштамма прототипаПоказатели ШтанинНзрфология Неполинорфай,граи- Полиморфнв 1, смесьполокителыее палоч- грамполовительных ики размером 0,8 х 3,5 мки грамотрнцательных клеток, палочкоеидная0,5 х 2 мкмСлоговые НеспоровыеПересев Через 20 дней35 С4,0-8,5Время культивирования 96 цасов10 1799395 Таблицэ 2 Показатели биохимического анализа силоса из нативной пшеничной соломы иизпредобработанной О, 5 раствором щелочил Характеристика опытных партий заквас Составитель М.СаубеноТехред М.Моргентал Корректор М.Демчи еда кто р А.Хода к изводственно-издательский комбинат "Патент", г, УжгОрод, ул.Гагарина, 1 Заказ 789 ВНИИПИ Государственн 113 Оажкомитета по изобреМосква. Ж, Рауш Подписноениям и открытиям при ГКНТ СССРая. наб 4/5