Способ определения холестерина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1/28, 1/46 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ, 1988,ов Н.Ю.филипповова 57) Использование: меивный анализ, Цель и цина ферментабретения - повы ваемого способа заключаются в 4) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛЕСТЕА Изобретение относится к области ферментативного анализа и может быть использовано в клинических исследованиях при диагностике атеросклероза, диабета, мочекаменной болезни, функциональных расстройств печени и некоторых инфекционных заболеваний.Известен также способ определения холестерина, основанный на измерении скорости выделения пероксида водорода. Определение холестерина данным способом, который по своей сути наиболее близок к заявляемому изобретению, выполняется следующим образом. Аликвота исследуемого образца, например сыворотки крови, вносится в измерительную кювету спектрофотометра, содержащую реакционную смесь следующего состава:Буферная смесь 0,1 М, рН 5-9Субстраты пероксидазыСоли желчных кислот 1-20 мМ, Неионные детергенты - 0,1-10 г/л Холестеринэстераза 100 - 30000 ед/л Холестериноксидаэа 100 - 30000 ед/л,.ЫЛ 1788467 А51)5 6 01 й 33/48, 33/92, С 12 0 1/60,шение точности способа, Сущность изобретения: процесс осуществляют в две стадии, на первой из которых ведут обработку образца при температуре 20 - 55 С в течение 2 - 20 мин реагентом, содержащим холестеринэстеразу, буферную смесь и детергент, при этом происходит гидролиз этерифицированного холестерина. На второй стадии осуществляют окисление холестерина с помощью холестериноксидазы и регистрацию скорости образования пеооксида водорода. Регистрацию ведут хемилюминесцентным методом. 9 табл,Пероксидаза 2500 ед/л,Далее проводят регистрацию изменения оптической плотности при температуре 20- 40 С в течение 2 - 15 мин.Недостатки рассматриопределения холестеринаследующем.Оптимальные условия проведения реакций гидролиза и окисления не идентичны (не совпадают оптимум рН, температурный оптимум, концентрации детергентов), что приводит к использованию больших количеств ферментов.Проведение определения холестерина рассматриваемым способом основано на одновременном проведении 3-х последовательных реакций. Исходно в исследуемых образцах содержится как этерифицированный, так и неэтерифицированный холестерин, причем соотношение, этих форм холестерина может меняться в зависимости от сыворотки. Кроме того, скорость гидролиза этерифицированного холестерина холестеринэстеразой зависит от длины истепени насыщенности остатка жирной кислоты. Поэтому начальная скорость образования пероксида водорода зависит не только от общей концентрации холестерина, но и от соотношения разных форм холестерина в образце, что приводит к снижению точности определения.Целью изобретения является повышение точности определения,Поставленная цель достигается предложенным способом, заключающимся в том, что исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации состава; не менее 0,01 м/л буфера с рН 6,5-8,0; не менее 5 г/л холевокислого натрия и не менее 10 ед/л холестеринзстеразы, инкубируют не менее 2 мин при 25 - 55 С, после чего аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету. содержащую не менее 0,01 м/л при рН 8,0 - 8,6, не менее 0,003 ед/л пероксидазы, не менее 0,5 ед/л холестериноксидазы, не менее 0,1 г/л и-йодфенола и не менее 0,1 г/л люминала, с последующей регистрацией скорости образования пероксида водорода хемилюминесцентным методом.Предложенный способ отличается от известного порядком проведения операций, а именно, разделением стадии гидро- лиза и зкстракции со стадией окисления, что дает возможность осуществлять гидролиз в оптимальных условиях при температуре 25 -о Ф55 С не менее 2 мин, соотношением реагентов в гидролизующей и окисляющей смесях, а также тем, что регистрация скорости образования пероксида водорода осуществляется хемилюминесцентным методом,Указанные отличительные признаки позволяют повысить чувствительность определения,П р и м е р 1, К 0,02 мл сыворотки крови добавили 1,8 мл гидролизующей смеси (смесь 1: 0,1 М трис-НС., 15 0 г/л холевокислого натрия, 0,05 ед/мл холестеринзстеразы, рН 7.,2). После перемешивания инкубировали 20 минут, Затем из полученного раствора отбирали 0,1 мл и добавляли в измерительную кювету люминометра КВ 1250, доводили до обьема 1,0 мл смесью 2 (смесь 2: буфер 0,1 М трис-НС, рН 8,2, содеркащий 3,0 г/л холевокислого натрия, 0,5 ед пероксидазы, 0,05 ед холестериноксидазы, 0,1 г/л п-иодфенола, 0,1 г/л люминала), Перемешивали и через одну минуту фиксировали интенсивность люминесценции. П р и м е р 2, Условия измерений те же, что и в примере 1, за исключением того, что изменяли концентрацию пероксидазы. данные, приведенные в таблице 2, получены20 25 ные представлены в табл. 5,30 Из данных, приведенных в табл, 5, сле 35 40 45 50 55 5 10 15 для стандартной сыворотки с концентрацией холестерина 6,1 мкМ.Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что оптимальными концентрациями пероксидазы,при анализе являются концентрации не менее 0,003 ед/л.П р и м е р 3. Условия измерения те же, что и в примере 1, за исключением того, что изменяли концентрацию холестериноксидазы, Результаты измерений приведены в таблице 3 для стандартной сыворотки с концентрацией 6,1 мкМ.Из данных, приведенных в табл. 3, следует, что оптимальными являются концентрации холестериноксидазы не менее 0,5 ед/л,П р и м е р 4. Условия измерений те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию п-йодфенола. Данные приведены в табл, 4,Из данных, приведенных в табл. 4, следует, что оптимальной концентрацией ийодфенола является концентрация не менее0,1 г/л,П р и м е р 5. Условия измерения те ке,что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию люминола. Дандует, что оптимальной концентрацией люминала является концентрация не менее 0,1 г/л,П р и м е р 6, Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что при анализе стандартной сыворотки (5 мМ) используют различные значения рН при проведении первой стадии реакции гидролизэ. Результаты измерений приведены в табл. 6.Из полученных данных следует, что оптимальные значения рН для проведения реа кции гидролиза состэ вл я ют 6,5-8,0.П р и м е р 7, Условия эксперимента аналогичны условиям в примере 1, за исключением того, что используют различные концентрации холевокислого натрия в гидролизующей смеси, Результаты измерений приведены в табл. 7. На основании данных, приведенных в табл. 3, оптимальная концентрация холевокислого натрия в гидролизующей смеси составляет 5 - 20 г/л.П р и м е р 8, Условия проведения эксперимента аналогичны таковым в примере 1, за исключением того, что изменяют температуру, при которой проводится гидролиз (табл. 8).Из данных, приведенных в табл, 8 следует, что полный гидролиз зтерифицированного холестерина достигается при1788467 25 Таблица 1 аблица 2 температуре 25 - 55" С при концентрации холестеринэстеразы из поджелудочной железы в гидролизующей смеси 2 г/л(активность холестеринэстеразы 30 ед/л),П р и м е р 9, Условия эксперимента те же, что в примере 1, за исключением того, что изменяют концентрацию холестеринэстеразы в смеси, Данные представлены в табл, 9,На основании данных, приведенных в табл. 9, оптимальная концентрация холестеринэстеразы составляет не менее 10 ед/л при температуре 45-С и времени гидролиза 10 мин.Ф ормула изобретения Способ определения холестерина, включающий инкубацию исследуемой пробы в среде, содержащей буфер, субстрат пероксидазы, соль желчных кислот, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и пероксидазу и последующую регистрацию скорости образования перекиси водорода, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения 5 точности способа, исследуемую пробу добавляют в водную среду инкубации, содержащую буфер с рН 6,5-8,0 в концентрации не менее 0,01 М, холевокислый натрий в концентрации не менее 5 г/л, холестеринэ стеразу не менее 10 ед/л, инкубируют неменее 2 мин при 25 - 55 С, затем аликвоту инкубационной смеси вносят в измерительную кювету, содержащую буфер с рН 8,0-8,6 в концентрации не менее 0,01 М, холевокис лый натрий в концентрации не менее 1 г/л,пероксидазу не менее 3 ед/л, холестериноксидазу не менее 0,5 ед/л, и-иодфенол в концентрации не менее 0,1 г/л и люминол в концентрации не менее 0,1 г/л, а регистра цию проводят путем измерения хемилюминесценции.