Способ определения тиолов

(51)5 6 01 И 27/333 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПЙСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,Б бз па,1 ого Ргезз,СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИ ЛОаавй АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Институт биохимии АН ЛитССР(56) ЖАХ, 1983, т. 38. М 7, с. 1283.Оообзоп Н, ес а. 1 и. МеФоепау(пооду. Ед. Ьу МозЬоеп КйеЯап Ргапс 1 зсо,опбоп, Асадепис1976, ч. 44, р, 647. Изобретение относится к электрическим способам анализа. конкретно к усовершенствованию способа определения концентрации тиолов, соединений содержащих ЯН группу, и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве или других областях народного хозяйства для аналитических целей.Тиолы - класс органических соединений, содержащих при атоме углерода группу -ЯН (сульфгидрильную или меркаптогруппу). К тиоловым соединениям относятся и две аминокислоты - 1-цистеин и глутатион, которые встречаются во всех животных тканях и играют важную роль в биохимии клетки, Некоторые тиолы, как например 2,3-димеркаптопропанол, находят применение в медицине как антидоты при отравлениях мышьяком, ртутью и при других интоксикациях, а также при аритмиях сердца, гепатоце(57) Изобретение относится к электрохимическим способам анализа тиолов (соединений общей формулы РЗН) путем электролиза исследуемой пробы. С целью упрощения и уменьшения токсичности способа электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 5,5-8,0, с использованием графитовых электродов, модифицированных производными тетрациано-п-хинодиметана, тетратиофульвалена и ферроцена, при потенциале 0,2-0.1 В отн, н.к,э, Измеряется анодный ток, по увеличению которого определяется концентрация тиола. Способ может быть использован для анализа сточных вод и биологических жидкостей, 9 табл. ребральной дистрофии. Алифатические амины (2-меркаптоэтиламин) являются признанными радиозащитными агентами. Некоторые меркаптаны используют также в качестве пестицидов, в производстве полимеров и в других областях народного хозяйства. Поэтому определение тиолов важно не только в медицине, но и в сельском хозяйстве, мониторинге окружающей среды,Известен гальваностатический способ определения тиохолина, Определение выполняется в 0,08 М трис-НС буферном растворе, рН 7,4 с использованием сетчатого платинового анода и катода диаметром 1 см, предварительно подготовленный по спец- методике (кипячение в растворе НИОз, выдерживание в 3%-ном Н 2 РсС 16 и 0,03%-ном ацетате свинца при потенциале 25 В 5 мин, Получаются оба одинаковые электроды платинированной пластины, После первого измерения анод покрывается каким-то материалом, Через них пропускается постоянный ток величиной 2 мкА (снабжение током происходит от батареии 9 В) и определяется падение потенциала на аноде при наличии в растворе тиохолина, Концентрация тиола определяется по калибровочной кривой. Природа разности потенциала неясна, Он может определяться как редокс-превращением тиолового соединения, так и поляризацией анода из-за образования поверхностных соединений типа сульфидов платины.Недостатком этого метода является то, что в нем используются драгоценные металлы (платина), требуются специальные реагенты, часть которых ядовита и агресивна (НАВОЗ. НгРтСб, ацетат свинца). С использованием этой системы возможно определение тиоловых соединений лишь в чистых буферных растворах, в которых отсутствуют другие электрогенные соединения.Наиболее близким к предлагаемому является амперометрический способ определения тиолов в боратном буферном растворе, рН 8,2-8,6 с использованием амальгамированного серебряного электрода. Амальгамированный серебряный электрод представляет собой серебряную проволоку, впаянную или вставленную с помощью эпоксидной смолы в стекло. Для получения амальгамы серебра торец электрода шлифуется до зеркальной поверхности и опускается на 2 мин в металлическую ртуть. В электрохимическую ячейку с 5 мл буферного раствора неизвестной концентрации тиола вводится амальгамированный серебряный и насыщенный каломельный электроды. В. течение 20 мин удаляют кислород и проводят электролиз раствора при потенциале - 0,55 В отн, н,к.э, Концентрацию находят по градуировочному графику.В реакции тиохолина со ртутью образуются меркаптиды типа Н 92(ЯВ)2, где Й=СН 2-СН 2-й (СНЗ)з, которые восстанавливаются на электроде при потенциале - 0,55 В (отн, н.к.э):Н 92(ЯВ)2+ 2 Н+ 2 е - - 2 ЯЯН+2 Н 9Предельный катодный ток пропорционален концентрации тиола.Чувствительность ртутно-серебряного электрода 0,011 А/М,Недостатком способа является то, что он очень токсичен, так как включает использование металлической ртути, очень летучего и ядовитого металла, использование которого требует специально подготовленных и оборудованных помещений. Кроме того, метод неселективен, так как определение проводится при потенциале - 0,55 В отн. н,к.эпри котором осуществляется превращение многих примесных соедине ний, находящихся в реальных растворах - кислорода, ионов тяжелых металлов (РЬ, М), хиноновых и нитросоединений и др, Способ занимает много времени, так как перед каждым определением надо удалять кислород, который находится во всех водных растворах,Целью изобретения является упрощение и уменьшение токсичности процесса определения тиолов.Сущность способа обьясняется следующей схемой,Адсорбированный на графитовом электроде модификатор Мох реагирует с тиолами. Восстановленная форма модификатора 5 10 15 Мвос окисляется электрохимически при потенциалах их редокс-превращения;Мох+ 2 РЯН - .)Мвэс+ ЯЯ)г+2 Н,МБе - М,. 20 Способ реализуется с использованием вращающийся графитовый электрод, электродом сравнения служит насыщенный каломельный электрод, вспомогательным - Рс пластинка) определяется остаточный ток. В раствор вводится 50 мкл раствора тиола. В течение 30 с устанавливается новый стаци 50 онарный уровень анодного тока, по изменению которого определяется концентрациятиола.Зависимость тока электрода от концентрации тиола приведена в табл,1,Потенциал Е=0,15 В отн, н.к,э., скорость вращения электрода и) = 325 об/мин.Как видно из табл,1, калибровочные кривые обладают линейной характеристикой до 0,6-0,7 мМ (-цистеин, глутатион. 55 графитовых электродов, изготовленных из стержней (диаметром 5,9 мм) спектрально чистого графита, К одному концу стержня длиной 3-6 мм при помощи серебряного эпок сидного клея приклеивается медная проволока, другой конец шлифуется наждачной бумагой (250 мкм) и на нем адсорбируется модификатор. Электроды впрессовываются в тефлоновый корпус.30 П р и м е р 1, Определение тиолов;-цистеина, глутатиона, меркаптоэтиламина и дитиотриэтола с использованием графитового электрода, модифицированного тетрациано-и-хинодиметаном (ТЦХМ), 35 Электрод модифицируется путем нанесения на поверхность 40 мкл раствора ТЦХМ в толуоле (6 мг/мл). Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч, Электрод погружается в термостатированную при 40 25 С стеклянную ячейку с 20 мл 0,1 М калийфосфатного буферного раствора, рН 7,0, и с помощью полярографа "ОН 105" по 3-электродной схеме(в качестве рабочего электрода используется модифицированныймеркаптоэтанол, меркаптоэтиламин) и 0,25 мМ (дитиотриэтол). При больших концентрациях калибровочные кривые загибаются, Стандартные отклонения в линейных участках калибровочных кривых составляют 0,23 мкА для :цистеина, 0,28 мкА для глутатиона, 0,27 мкА для меркаптоэтанола, 0,24 мкА для дитиотриэтола и 0,36 мк 3 для меркаптоэтиламина. Чувствительность, т,е, тангенс угла наклона прямых, составляет 0,034; 0,014;0,030; 0,023 и 0,042 3/М для :цистеина, меркаптоэтанола, дитиотриэтола, глутатиона и меркаптоэтиламина соответственно(чувствительность по известному способу 0,011 3/М),П р и м е р 2. Электрод изготавливается как в примере 1, Проводится калибровка электрода по отношению к :цистеину и глутатиону при разных потенциалах электрода (табл.2). Концентрации: :цистеина 0,25 мМ, глутатиона 0,4 мМ. Другие условия как в примере 1;Как видно из табл.2, в интервале от 0,3 до,1 В практически можно провести измерения, но оптимальные условия проведения измерений обеспечиваются при потенциале 0,15-0,075 В отн, н.к.э., поскольку отношение тока электрода к остаточному току Я/й наибольшее при этих значениях потенциала, Ниже указанного предела (т.е, - 0,2 В) не наблюдается окисление тиолов, а при потенциале более 0,2 В значительно возрастает остаточный ток, обусловленный побочными электрохимическими превращениями на рабочем электроде.П р и м е р 3, Электрод изготавливается как в примере 1. Проводится калибровка электрода пв отношению к-цистеину, глутатиону и дитиотриэтолу при разных рН во всем интервале рН калий-фосфатного буферного раствора (табл,3),Концентрации; 1- цистеина 0,15 мМ, глутатиона и дитиотриэтола 0,10 мМ. Потенциал электрода 0,15 В отн, н,к,э, Другие условия как в примере 1.Как видно из табл.3, при рН 5,5-8.0 проходит окисление тиолов, поэтому в данном интервале способ может быть осуществлен, Однако с переходом из кислых сред к нейтральным и слабощелочным увеличивается ток, Следовательно, наибольшая чувствительность определений обеспечивается при р Н 7,25-8,0.П р и м е р 4. Электрод изготавливается как в примере 1, Определяется зависимость тока электрода от скорости вращения электрода при потенциале 0,15 В (табл.4), Другие условия как в примере 1,Как видно из табл, 4, при повышении скорости вращения электрода стационарный ток увеличивается незначительно. Поэ(ТТ).20 На графитовый электрод диаметром5,9 мМ наносится 40 мкл раствора ТТФ в толуоле (34 мг/мл). Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч, электрод погру 25 30 35 40 45 50 55 51015 тому во всех исследованиях использована достаточная скорость вращения 325 об/мин.П р и м е р 5, Определение стабильности электрода во времени. Электрод изготавливается как в примере 1, В течение 2 мес измеряется величина тока в присутствии 0,5 мМ :цистеина, Условия определения как в примере 1, РезультатыО зависимости тока от продолжительности сохранения электрода представлены в табл,5,Из табл,5 видно, что модифицированный ТЦХМ электрод сохраняет работоспособность в течение не менее 2 мес. За это время ток падает только на 20.П р и м е р 6. Определение тиолов с использованием графитового электрода, модифицированного тетратиофульваленом жается в 20 мл 0,1 М калий-фосфатного раствора, рН 70,0, и определяется ток. В раствор вводится 50 мкл раствора,тиола в том же буферном растворе. В течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень тока электрода,Зависимость тока электрода от концентрации тиола приведена в табл.6, Е=0,1 В отн, н.к.э, (только в случае-цистеина 0,15 В), в =325 об/мин, 1= 25 С.Как видно из табл.6, калибровочные кривые обладают линейной характеристикой до 0,5-0,6 мМ (1:цистеин, глутатион,меркаптоэтанол и меркаптоэтиламин) и до 0,25 мМ (дитиотриэтол), При больших концентрациях калибровочные кривые загибаются, Стандартные отклонения в линейном участке калибровочных кривых составляют 0,36 мкА для 1:цистеина, 0,05 мкА для меркаптоэтиламина, 0,004 мкА для глутатиона,0,003 мкА для меркаптоэтанола и 0,34 мкА для дитиотриэтола, а чувствительность составляет 0,034; 0,001; 0,003; 0,020 и 0,005 А/М для :цистеина, глутатиона, маркаптоэтанола, дитиоэтола и меркаптоэтиламина соответственно.П р и м е р 7, Электрод изготавливается как в примере 6. Проводится калибровка электрода по отношению к :цистеину и глутатиону при разных потенциалах электрода(табл,7), Концентрация :цистеина 0,5 мМ, аглутатиона 0,1 мМ, Другие. условия как впримере 6,Как видно из табл.7, и остаточный ток, и ток электрода значительно уменьшаются при изменении потенциала от+0,2 до -0,1 ВГлутатион 1:цистеин 1,мкА мМ 1,мкА 1,мкА мМ 1,мкА 1,мкА 3,96 7,56 11,16 14,6418,00 21,00 23,64 26,16 28,32 30,36 31,32 33,48 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 2,28 4,68 7,329,96 12,12 14,28 16,2 18,2 19,92 21,96 23,76 25,68 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,92 3,12 4,56 6,24 7,20 9,36 10,44 11,40 12,00 12,96 13,92 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0;30 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 2,04 3,60 5,04 6,36 7,80 9,00 10,32 11,20 12,48 13,56 14,40 15,36 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 4,32 9,12 13,44 17,52 21,84 25,92 29,52 33,36 37,44 40,80 48,00 отн. н.к.э. Наилучшее отношение Яlй в области 0,15-0,05 В отн, н,к.э.Пример 8, Электрод изготавливается как в примере 6. Проводится калибровка электрода по отношению к 1 - цистеину, глутатиону и дитиотриэтолу при разных рН (табл.8), Концентрация :цистеина 0,4 мМ, глутатиона 0,9 мМ и дитиотриэтола 0,2 мМ, Е = 0,1 В отн,н,к,э.Другие условия как в примере 6.Как видно из табл,8, чувствительность электрода значительно вырастает при переходе из кислых сред в нейтральные и щелочные.П р и м е р 9, Определение тиола с использованием графитового электрода, модифицированного ДМФЦ (53 мг/мл).Растворитель упаривается в воздухе в течение 2 ч. Стационарный ток окисления тиола регистрируется как в примере 1, Зависимость тока электрода от концентрации меркаптоэтиламина в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 7,0, при потенциале 0,1 В отн, н.к,э., в = 325 об/мин, 1= 25 С приведена в табл.9.Как видно из табл.9, калибровочная кривая обладает линейной характеристикой от 1 мМ, чувствительность в этом интервале 0,003 А/М, стандартное отклонение 0,03 мкА,Преимуществом способа является упрощение определения концентрации тиолов, вступающих в реакцию с модификатором на графитовом электроде с образованием вос становленной формы медиатора, его последующим электрохимическим окислением и увеличением анодного тока. В отличие от известного способа исключено использование металлической ртути, что требует специ ально подготовленного и оборудованногопомещения. Исключается также предварительное удаление кислорода перед определением, занимающее 20 мин; используемый электрод не реагирует на кислород, способ 15 более специфичен и экспрессивен. Формула изобретения Способ определения тиолов, включающий электропиз исследуемого вещества в 20 буферном растворе и измерение тока с последующим определением концентрации тиола, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса и уменьшения токсичности, электролиз ведут в калий-фосфатном 25 буфере в интервале потенциалов от 0,3 до-0,1 В отн. н,к,э, с использованием графитового электрода, химически модифицированного производными тетрацианохинодиметана, тетратиофульвалена или ферроцена, и кон центрацию тиола определяют по увеличениюанодного тока.1728771 12 Таблица 5 Таблица 6 Меркаптоэтанол Дитиотризтол Глутатион Меркаптоэтиламин. Редактор В.Петраш Заказ 1404 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Меркаптоэтиламин, мМ