Способ определения активности лизосомальных ферментов

. СОЗОЭ СОВЕТСНИХсаиРЕСПУБЛИН ИЕ ОИ 0(71) Тбилисский ордена ТрудовогоКрасного Знамени государственныйуниверситет(56) 1, Мещпер Д. Химические, реакциив живой клетке. Биохимия, т 2. М1980.2. Покровскйй А.А., Тутельян В,А,.Лизосомы. М., "Наука", 3976,. с, 130133 (прототип),(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТ 13 ВНОСТИ ЛИЗОСОИАЛЬН 13 Х ФЕРМЕНТОВ. путемлабилизации мембран лизосом с последуюшнм определением ферментативнойактивйости, о т л н ч а.ю щ и й с ятем, что, с целью повышения чувстви-:.тельности способа, в качестве лабилизатора используют углеводород ант"раценового ряда, выбранный из группы:1,2-бензнирен; 3,4-бензпирен; 9,30".дйметил,2-бензатраацен; антраценв концентрации 20-200 мкг на 300 мкгбелка .лнзосом.Для этого к 1,5 мл субстратаглицерофосфата, рН 4,9 приливают0,5 млмл сахарозы и помещают,на15 мин в водяную баню при 37 С, пос-ле чего добавляют 0,2 мл гомогената и инкубйруют 10 мин на водянойбане. Затем инкубационную смесь охлаждают и реакцию останавливают добавлением 2 мл холодной О -ной три" .хлоруксусной кислоты, смесь цент"рифугируют 1 О мин при 3000 об/мнн.К 2 мл надосадочной жидкости добав-ляют 0,5 мл молибдата аммония и1 мл 17 аскорбиновой кислоты, Через5 мнн определяют оптическую плот"ность на ФЭК-е при длине волны635 нм,По увеличению активности кислойфосфотазы судят о степени лабили"зации мембраны.П р и и е р 1. Лизосомы печеникрыс инкубируют с 1,2-бенэопнренрмн с известным лабилиэатором витаьяном А. В каждой отдельной пробеконцентрации 1,2-бензопирена составляла 20, 100, 200, 300, 400, 500,550 мгк/100 мкг белка лизосом, аконцентрация витамина А - 100, 200,300, 400, 500 и 600 мкг/ 100 мкгбелка лизосом. Условия инкубациии определенйе активности кислой фосфатазы (степени лабилизации мембраны приведены выше),Результаты типичных измеренийпредставлены в табл. 1.П р и м е р 2, Лиэосомы печеиикрыс инкубируют с 1,2-бензпиреном,3,4-.бенэапиреном, .9,О-диметил,2 бензантраценом, антраценом и витамином А в концентрации 150 мкг лабилизирующего агента на 100 мкг бел"ка.Результаты приведены в табл. 2(условия инкубации и измерения ана- .логичны примеру 1).,Полициклические углеводороды ант"раценового ряда вызывают лабилизациюмембран лизосом в 2-3 раза более интенсивную, чем известные природныелабилизаторы и могут быТь использованы в самых раэнообразиьв биошмических и медицинских экспериментах,связанных с лабилизацией биомембран. для определения активности лизосбмальных Ферментов. 1053004Изобретение относится к фармако- "логии и может быть использовано вбиохимии, биофизике и онкологии приопределении ферментативной активности ферментов, локализованных вмембранах лиэосом.Известен способ определения .фер". ментативной активности мембранныхферментов:путем обработки мембраннойфракции детергентами, поверхностноактивныьв веществами 11,Однако поверхностно-активные вещества существенно нарушают нативныесвойства изучаемых ферментов, а также затрудняют определение фермента- . 15"тивной активности,Известен способ определения Ферментативнойактивности лизосомольных. ферментов путем лабилизации мембран лизосом витамином А 2. 20Однако данное соединение вызываетлишь незначительную лабилизациюмембраны, причем активные концентрации лабилизатора должны значительнопревышать концентрации измеряемыхферментов.Необходимость высоких концентраций лабилизатора снижает чувствительность известного способа.Цель изобретения - повышение чувствительности способа,30Указанная цель достигается тем,что согласно способу определенияактивности лизосомальных ферментовпутем лабилизации мембран лаосомс последующим определением фермен- З 5тативной активности, в качестве лаФбилизатора используют углеводородантраценового ряда, выбранНый изгруппы: 1,2"бензпирен; 3,4-бензпи"рен; 9,10-диметил,2-бензатрацен; 1 Оантрацен в концентрации 20"200 мкг;образом.К суспензии лизосом, выделенных 45гиз печени крысмл суспензии.лизо-сомв 0,25 м сахароза) добавляется0,1 мл полициклкяеского углеводорода, растворенного в этиловом спир-те (конечная концентрация от 20 до 50200 икг на 100 мкг белка лизосом),Смесь инкубируется при кометнойтемпературе 30 мин. Затем в суспензии лиэосом определяют активность,4Т а б л и иа Ч 053004,Активность Концентрация Активнос фермента, . витамина А; ферментамкг Концентрация1,2-бензпирена, мкг Контрол Контроль 02 О, 024. 04 2,0 0,058 0,028 0,025 50 0,065 50 6 Т а бЬ и ц,а тивность ферментамкмоль/мин/мг белк тво р 1емб раны Исхо О итамин А 2-Бензнире 5 0,072 Б ен 9, 0-Днметнлантрацен енз- .0,09 0,086 Ко ректор .О. Тигор 2 Подписное.ССР а 4 атент , г; Ужгород, ул. Проектная,/Составйтейь С. Мотелеведактор Н, Ковалева Техвещ .:П.ЗЬаещаказ 8863742 Тираж 873ВНИИПИ Государствеаиого комитетапо делам изобретений:и открытий1)3035 Москва Ж-Я .Рааская ка