Способ приготовления системы для дифференциации энтеробактерий

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИНЕСкиХРЕСПУБЛИК 50 171763 чю С 12 0 1/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР ТЕТРЫТИЯМ ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ едовательскии кробиологииова и И,В. СоСССР985,нию систем АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) Патент США М 3951747,кл. С 12 К 1/06, 1976.Авторское свидетельствойт 1337409, кл. С 12 0 1/04. 1Инструкция по применеВарб О 20 фирмы Ар,Изобретение относится к микробиолоии и касается способа приготовления диффе ренциально-диагностических сред. Известен способ приготовления лиофилизированной среды состава, %: углевод.1; пептон 0,5; феноловый красный 0,0018; растворитель 100 мл.Ингредиенты перемешивают при комнатной температуре. затем автоклавируют при 118 С в течение 15 мин, после чего.помещенные в водяную баню при 50" С микро- пробирки размером 10 х 75 мм заполняют средой. Количество среды, помещенное в каждую пробирку, составляет 0,1 мл. После заполнения пробирки помещают в камеру лиофильной сушки при -40 С и выдержива- ют 1 ч. В камере устанавливают вакуум, Затем камеру подогревают до 21 С в течение 24 ч, после чего вакуум разрушают и пробир- ки вынимают. Полученную таким образом среду хранят с осушителем и расходуют по мере надобности,(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ(57) Использование: медицина, микробиология, биотехнология, Наборы для дифференциации энтеробактерий готовят путем приготовления питательных сред. содержащих раствор бромтимолового синего, Дифференциальную среду. вносят в лунки пластины, высушивают при 38 - 40 Си о временно стерилизируют УФ. После подсушивания в лунки дополнительно вносятполивиниловый спирт. 1 з.п. ф-лы, 2 табл. Недостатками данного способа являются сложность, длительность (25 ч) и многоэтапность, а также необходимостьиспользования осушителя при хранении.Известен также способ получения питательной среды для идентификации энтеробактерий состава, г/л: основной субстрат -лимоннокислый натрий 5,0-6,0; вспомогательные субстраты - глюкоза 0,6 - 0,7; калийфосфорнокислый однозамещенный 0,81,0; пептон 1,0-1,2; цистеин 0,02-0,04, фосфорнокислый аммоний 0,5-0,7; хлористыйнатрий 5,0 - 7.0; индикаторы - бромтимоловый синий 0,08 - 0,1; крезоловый красный0.08-0,1: дистиллированная вода остальное,Среду разводят в десятикратно меньшем объеме воды и .микродозируют по0.02 мл в ячейки полимерного планшета,высушивают, стерилизуют ультрафиолетом.(УФ) и герметизируют. Для стабилизациисреды добавляют поливиниловый спирт(ПВС) на этапе растворения в количестве5 10 15 20 25 35 40 50 0,8-1 г/л. В таком виде среда долго хранится.Технологические возможности способа могут быть расширены, увеличена номенклатура сред, приготавливаемых в пластинах биохимических, дифференцирующих энтеробактерии.Известен способ приготовления системы для дифференциации энтеробактерий Вар бО 20 Е фирмы Ар, который основан на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией,В качестве аминокислот в данной системе используют лизин и орнитин, а в качестве индикатора - бромкрезоловый пурпурный, высушивание ведут путем лиофилизации, стерилизацию проводят при помощи автоклава (по традиционно сложившейся практике создания систем данного вида). Известный способ не всегда обеспечивает т ность дифференциации, слажен изза необходимости использования дополнительного оборудования (автоклава, установки для лиофилизированной сушки),Целью изобретения является повышение точности дифференциации и упрощение приготовления и использования системы.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготовления системы для дифференциации энтеробактерий, оскованному на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией, в состав среды в качестве аминокислоты вводят аргинин, а в качестве индикатора - спиртовой раствор бромтимо-. лового синего, а высушивание пластин ведут при 38-40 ОС с одновременной стерилизацией ультрафиолетом; а также тем, что в лунки пластины после высушивания среды вносят поливиниловыйспирт.Включение теста с аминокислотой - аргинином обусловлено его большой диагностической значимостью. Данный тест является ключевым при диффервнциации микроорганизмов рода ЕмегоЬас 1 ег. Тест, на аргининдигидролазу - один. из основных дифференцирующих СтгоЬасег агпаопат 1 сОз от других видов этого рода и является также разделяющим род КеЬзеПа от рода ЕптегоЬасег наряду с тестом на подвижность. Таким образом, введение в состав системы теста на аргинин повышает ее точность, упрощает идентификацию, избавляет от необходимости использования дополнительных тестов.Предварительное растворение индикатора бромтимоловога синего в этилавом спирте способствует более тщательному его растворению, чем, если бы его растворяли вместе с остальными компонентами среды с применением воды. Использование в качестве растворителя для смеси компонентов этилового спирта приводит к перенасыщению среды алкоголем, и полученная среда обладает большим ингибирующим эффектом по отношению к выращиваемым на среде микроорганизмам,Режим высушивания при 38 - 40 С является наиболее оптимальным, так как эта температура неблагоприятна для развития микроорганизмов и не приводит к деформации полимерного планшета, в котором находится среда,Одновременное облучение УФ ведет к сокращению времени получения среды и обеспечивает условия стерильности на всем протяжении этапа высушивания. Кислая среда, необходимая для активизации декарбоксилазы аминокислот (рН 5,0), делает невозможным внесение в раствор ПВС, так как данный рН среды способствует его свертыванию, Поэтому для обеспечения стабильности ва время хранения ПВС вносят после этапа высушивания,П р и м е р 1. Различные концентрации компонентов среды приведены в табл. 1.В качестве аминокислоты используют аргинин. Сухие компоненты среды смешивают, добавляют витамин и йредварительно приготовленный индикатор-бромтимоловый синий, затем полученную смесь доводят до 100 мл стерильной дистиллированной водой, устанавливают рН 5,0, дозируют по 0,02 мл в ячейки дифференцирующей пластины и сушат при 40 ОС с одновременной стерилизацией УФ-лучами.Испытание среды проводят с помощью контрольных штаммов микроорганизмов. Результаты испытаний на примере среды с аминокислотой - аргинином представлены в табл, 2,Результаты испытаний показали, что в опыте с 5-й композицией среды (с самым минимальным содержанием составляющих компонентов) наблюдаются нестабильные результаты, запаздывание ферментации, и эти реакции расцениваются как отрицательные.1717635 Таблица 1 45 Так, например, у СтгоЬастег ава 1 опабсоз и ЕптегоЬастег соасае (табл. 2) отмечены отрицательные результаты приположительном контроле (в качестве контроля используют классическую среду Биргера - Крушинской), Композиции 1 - 4испытывают в тех же условиях, что и композицию 5, Данные среды работают хорошо,положительные результаты фиксирутся всрок, окраска индикатора при положительной реакции контрастная по отношению кокраске отрицательной реакции, Композиция 1 исключена из зкономических сообракений, так как нецелесообразно .дополнительно расходовать реагенты при 15хороших результатах на средах с меньшимих содержанием,Таким образом, композиции 2-4 выбраны как оптимальные.П р и м е р 2. Осуществляют как пример 201, Готовят композицию 3 (табл. 1), меняютдиапазон температуры сушки от 38 до 40 С.Оптимальная температура сушки, выбранная в пределах 38 - 40"С, неблагоприятнаядля развития микробов, кроме того, температура ниже 38 С значительно затягиваетсроки сушки, что отражается на качествепрепарата. Температура выше 40 С разрушает некоторые компоненты среды и ведетк деформации полихлорвинилового планшета, в который разлиты среды.П ри ме р 3, Осуществляют как примеры1 и 2. Готовят композицию 3 за исключением вводимого количества индикатора. Ккомпозиции 3 (без индикатора) прибавляют 35индикатор в различных объемных процентах (от 9 до 13), Полученные вариантысред высевают на бактериальную контаминацию.Вариант с 9;4-ным содержанием этилового спирта признан непригодным, так какпри высеве на стерильность наблюдается рост микроорганизмов .выше, допустимой нормы (20 колоний на 1 чашку). Варианты с 10-13 О -ным содержанием этилового спирта пригодны; наблюдается допустимый рост микробов, Таким образом, варианты среды с 10 - 12;ь-ным содержанием этилового спирта признаны оптимальными. Вариант с 13 О-ным содержанием этилового спирта не учитывается из-за удовлетворительных результатов на вариантах среды с более низким его содержанием.Предлагаемый способ позволяет приготовить дифференциально-диагностические среды разного состава, которые в совокупности могут образовывать идентификационную систему одноразового использования, пригодную для полевых условий. Сокращается время приготовления среды за счет совмещения стерилизации с высушиванием,Формула изобретения 1. Способ приготовления системы для дифферей 1 иации энтеробактерий, основанный на выявлении биохимической активности микроорганизмов в отношении сахаров и аминокислот путем приготовления набора дифференцирующих питательных сред, содержащих субстрат и индикатор,с последующим разливом среды в лунки пластины, высушиванием и стерилизацией. о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности дифференциации, упрощения приготовления и использования,. в состав среды в качестве аминокислоты вводят аргинин, а в качестве индикатора - спиртовой раствор бромтимолового синего, а высушивание пластин ведут при 38-40 ОС с одновременной стерилизацией ультрафиолетом.2, Способ пои. 1, отл ича ющийся тем, что в лунки пластины после высушивания среды вносят поливиниловый спирт,1717 Ь 35Таблица 2Составитель И,Соловьева Редактор И,Дербак Техред М.Моргентал Корректор И,Муска Заказ 853 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101