Способ количественного определения витамина а

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 16846 19) (1 51) С 01 и . фщАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ енияодукасля-исследовате онов анаЛ, С, Д,оды опрея качества1981,амины б, ме пытанИ. ЕНИОГО ЛЕости ветличество витамина А рассчитывают по величине изменения интенсивности окраски цветного комплекса при 610 нм. При извлечении витамина А из матер лов, содержащих липиды перед экст цией органическим растворителем проэодят целочное омыление.Для повышения селективности метода в качестве комплексообраэователя используют эфират трифторида бора, кото рый образует окрашенный комплекс толь ко с виталинол А. При этом этот комплексооЬразователь взаимодействует со всеми формами витамина А в отличие от других колплексообрээователей, например, трихлорида сурьмы, который дает окраску только лишь при взаимодействи со спиртовой Формой витамина А, Эфира иараккоГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Украинский научнский институт птицево(54) СПОСОБ 1:ОЛЧЕСТВмил ВитАВнА А 57) Изобретение относится к пищево армацевтической, химической и сель ИзоЬретение относится,.к, пищевой,фармацевтическойхилической и сельскохозяйственной промышленности и может Ьыть использовано для определения витамина А в различных пищевыхпродуктах, биологическом материале,в масляных концентратах, витаминныхпремиксах и т,д., а также при контроле производства витамина А,Целью изобретения является повышение точности определения,Для осуцествления данного способаиэ отобранной пробы анализируемогоматериала извлекают витамин А экстракцией органическим растворителем проводят цветную реакцию витамина А сэфиратом трифторида бора при конечнойконцентрации последнего 16-20, а скохозяйственной промышленности и жет быть использовано для определ витамина А н различных пицевых пр тэх, биологическом материале, в м ных концентратах, витаминных прем сах и т,д. Цель - повышение точно определения, з отобранной пробы лизируемого материала извлекают в тамин А экстракцией органическим ворителем, осуцествляют взаимодей вие витамина с комплексообразоват в качестве которого используют эф трифторида бора, с конечной конце рацией 16-20 ф. оличество витамин определяют по изменению интенсивн окраски при 610 нм образующегося ного комплекса, 1 э.п. ф-лы, 1 ил 3 табл.три 9 Торида бора менее токсичен, чемтрихлорид сурьмы, Окрашенный комплексвитамина А и эфирата трифторида бораобразуется во всех неполярных органических растворителях (гексан, бензол,хлороформ, дихлорэтан и т,д,). Скорость распара комплекса для разных"растворителей не одинакова, например,в гексане данная реакция протекаетоцень быстро, что затрудняет анализ,Наилучшие результаты получены при использовании хлороформа,Для уменьшения ошибки измерения приоднократном измерении оптической плот ности, связанной с распадом окрашенного комплекса, количественно определение витамина А производят в данномспособе по изменению интенсивностиокраски цветного комплекса при 20610Способ иллюстрируется чертежом,На чертеже графически отражена кинетика реакции распада цветно о комплекса после добавления к раствору, 25содержацего витамин А, эфирата трифтозида бора в количестве 1 мл. Покаэаа часть спектра этого комплекса втервале 550 - 630 нм. Цифра 1 соответствует величине оптической плотнос, З 0ти оаствора через 30 с после добавления эфирата трифторида Сора, Все последуацие измерения (цифры 2 - 9) про"водились через каждые 60 с. Образовавцаяся син,я окраска цветного комплекса витамина Я и эфирата трифторидабора со временем постепенно ослабева"ет и теряет свою интенсивность, Наибольшая скорость изменения окраскинаблюдается в первую минуту течения 40реакции (интервал между цифрами 2 и1 - наибольший), В дальнейшем скорость распада комплекса постепеннозамедляется, что отражено в уменьше"нии интервала между всеми последуюци" 45ми цифрами,Из этого следует, что проводить регистрацию изменения скорости распада цветного комплекса следует в первую минуту, так как в этот момент измерения будут более точными и чувствительныли.На необходимость проведения измере 1 ний в первую минуту течения реакции55 ,указывает также и то, что по мере ее хода начинает появляться и регистрироваться дополнительный пик (пик Б), вызванный образованием посторонних продуктов распада комплекса,мешающих определению витамина А. Помере течения реакции основной пик,где согласно предлагаемому способунеобходимо проводить измерения, постепенно уменьшается уменьшается соответственно и разность между двумяизмерениями, Одновременно растет допслнительный пик, что вызывает завышение полученных результатов и снижениетсчности анализа.измерения скорости распада цветно"го комплекса проводят в начальный момент хода реакции: согласно данномуспособу это делается через 30 с после смешения реагентов,П р и и е р 1. Определение витамина А в печени кур (вариант с омылением),Навеску гомогенизированной куринойпечени (200 мг) заливают 50 мл этанола, добавляют 1 г гранулированнойгидроокиси натрия, 100 мг пирогаллолаои нагревают в течение 30 мин при 90 Сна водяной бане. Затем гидролизат охлаждают, переносят в делительную воронку, витамин А экстра гируют триждыиз 30 мл гексана, Обьединенный гексанэвый экстракт выпаривают досуха нароторном испарителе, сухой остатокрастворяют в 1 мл хлороформа,Для анализа берут р мп хлороформно"го раствора, добавляют 1 мл эфирататрифторида бора по стенкам пробирки,слешивают и включают секундомер. Через 30 с после смешания делают первоеизмерение оптической плотности раствора на длине волны 610 нм, Затем.через 1 мин после первого измерения проводят второе измерение. По разницемежду вторым и первым измерениями рассчитывают изменение оптической плотности раствора и по величине этогоизменения, используя калибровочныйграфик, рассчитывают содержание вита 1ина А в анализируемом образце,Согласно данному примеру в печенигроводится измерение витамина А в виде его спиртовой формы - ретинола,П р и м е р 2. Определение витамина А в печени кур (вариант беэ омыления),Навеску гомогенизированной куринойпечени (200 мг) вносят в фарфоровуюступку, насыпают туда г г безводногосульфата натрия и тщательно перетирают до получения однородной массы.При этом происходит иэмельчение пече 165 цббни и одновременное ее обедоживание,рто необходимо для следующего этапаэкстракции витамина А. Затем в ступку наливают 10 ил хлороформа, хорошоперемешивают пестиком и содержимоефильтруют в пробирку через бумажныйфильтр, Потом дважды помл ополаскивают ступку хлорофориол, переносят егона тот же Фильтр и содержимое пробир Оки доводят до 15 мп хлороформолВседальнейшие процедуры выполняют также,как описано в примере 1,Таким образом, в данном вариантеопределения витамина А исключаютсп тдкие длительные процедуры как омыление, отмывка экстракта и его выпаривание, Это значительно сокращает времяанализа и повышает его точность засчет сокращения ряда операций,Согласно данному примеру в печениопределяется витамин А в ндтивной форме, в которой он присутствует в тканях, а ииенно в виде ретинилпальмитата, т.е. эФирной Форме, поскольку эфират трифторида бора позволяет определять все Формы витамина А,П р и м е р 3. Определение витамина А в маслянои концентрате,Все производимые масляные препара ты кдк для витаиинизации продуктов питания человека так и для обогащения комбикормов животных представляют соей эфирные формы витамина А в масле- например, ретинилпальмитат или ретинилацетат,1 ил масляного препарата витамина А (активностью, например, 100 тыс. интернациональных единиц в мл) растворяют в 10 ил гексана или хлороФорма в 40 мерной колбе. Затем 1 мл полученного раствора переносят в другую мерную колбу на 100 мл с хлороформом и хорошо переиешивают, Таким образом, первоначальный масляный препарат разбави ли в 10000 раз. 1 мл разбавленного таким способом раствора витамина А вносят в химическую пробирку, доливают 4 ил хлороформа и перемешивают, Затемв пробирку приливают 1 ил эфира трифторида бора и все измерения проводяттакже кдк описано в примере 1,П р и л е р л, Определение оптимальных количеств эфирата трифтрридабора для проведения реакции с витами- уном А,В табл. 1 представлены данные поопределению витамина А при добавлении к анализируемому образцу различных к. лчеств эФирдта тр Фторида бора. Для испытаний был взят,стандарт ный раствор зитаиина А с известной концентрацией и в каждый образец вно - сипи по . икг ретинола. Из данных та 6- лицы следует, что прн добавлении к хлорофориенноиу рас 1 вору 0, 1-0, 7 ил реагента анализ искомого компонента 1 ле представляется возложным, гдк как в этих соотношениях получается мутный раствор, который невозможно Фотоиетрировдть. Раствор становится прозрачным только при добавле лии б- лее 8 ип эфирдтд трифторида бора (ндйрииер 35 ил цветореагентд и 42 ил хлороформе иного раствора витамина А; 1 Э лл цветорезгентд и Ч мл раствора и тдк рдлее),Увеличение концентрации эфиратд грифторидд бора более 1 ь" (что соотдетствуог добавлению 08-10 л реагентд к хлороФориенноиу раствору общии объеиои 5 ил) нецелесообразно, тдк капри этом точность анализа не повншается. Поэтому с целью экономии цветореагентд Ьыл выЬран интервал 0,8-1,0 лл, т,е. 16-20 л,.П р и и е р 5, В табл. 2 и 3 представлены результдтьг сравнительных испытаний данного способа, который проводился так как описано в примере 3 и прототипа. Из таблицы видно, что предлагаемый способ определения витамина А превосходит известный как по точности определений, так и по селективности определений, 1(роме того, спо. соб значительно упрощается, так как нет неоЬходииости проводить щелочное опыление масляного препарата витамина А, тогда как в известном способе этд процедура оЬяздтельна.Использование в качестве цветореагента эфирата трифторида бора позволяет определять витамин А в любой его шорие (спиртовой, эфирной и т,д,), значительно сокращает время анализа материалов, не содержащих липиды тдк как позволяет оЬойтись без целого ряда таких операций как оиыление, отмывка экстракта и.выпаривание растворителя. Данный способ позволяет проводить опредение витаиина А во много- компонентных смесях, содержащих самые различные вещества так как эф 1 рат трифторидд 6 ора является специфическим реактивом по отношению к ретинолу.7 1684661 ВИспользование менее токсичного комствляют путем экстракции органическимплексообразователя улучшает условияработы аналитиков,растворителем, в качестве комплексообразователя используют раствор эфираф о р м у л а и э о б р е т е н и я 5 та трифторида бора с конической концентрацией 16-20 Ф) а измерение энаце"1. Способ количественного определе- ния оптической плотности осуществляютния витамина А, включающий отбор про- путел фиксации изменения интенсивносбы анализируелого материала, иэвлече- ти окраски при 610 нм,ние из него витамина А, взаимодейст"вие последнего с комплексообразователем и измерение значения оптическойплотности образующегося окрашенногосоединения, соответствующее количест,ву витамина А, о т л и ч а ю щ и й 15с я тем, что, с целью повышения точ 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что при извлечении витамина А из материалов, содержащих липиды, перед экстракцией органическим растворителем проводят щелоцное опыление. Таблм ца 1 Добавлено эфирата трифторида бора, мл 0,4 а,б 0,7 0,8 0,9 1,О Показатель о1 З Определеновчтамина А,мкгВыход знализир;. с.мого вецестСрва,4 92 4,95 4,95 4,94 4,94 Раствор мутный 98, 4 99, 1 99, 1 96)9 99, 2 Таблица 2 Найденовитами на, А, о Средняя продолжи"тельность анализа, мин Кол-во витамина Ав 1 мл препарата,мкг Добавленовнутреннегостандар"та, мкг"пособ Кол-во определений 1 редла га елыйИзвестный 96,8 84,2 45,8+0,25 Зь,1+2,47 20 90-100+Определение витамина А согласно известному способу в данном случае даетзавышенный результат, так как треххлористая сурьма не является специфичнымреактивом для витамина А и дает окрашивание с другими веществами, присутст.вующими а растворе,1684661 оставитель И. Пинуевехред Л, Сердюков а К А. Обручар актор 3. Трубченко Заказ 3502 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета по изобрет 113035, Москва, Ж"35, Раушсдписное КН иям и открытиям я наб., д. М 5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,10