Способ выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле

)5 С 01 И 27/2 йОсййаЬЛ ПИСАНИ ТЕНИЯ Пирогов ательсИзобретение синолиза на конц сопи с фильтромсмеси отделяют фмол.в. менее 100 нтраторе фирмыМиз пептиднакцйи пептидов0 Д именно к биолается способазоэлектрофокусольной системе овании .в борат-полполиакриламидном е,ля- его ирован" ара- .СвтеГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(11) 2-й Московский государственныймедицинский институт им. Н,И.и Центральный научно-исследовкий институт эпидемиологии(56) Остреман Л.А. Методы исследования белков и подклеточных кислот,М,: Наука, 1981, с. 93.(54) СПОСОБ ВЬКВЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ ПРИИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИИ В ПОЛИАКРИЛЫ 61 Д 01 ГЕЛЕ тносится к медицине,гической химии, и ка щвления белков при Целью изобретения является опреде ление изоэлектрической точки белков низкомолекулярных.пептидов.П р и м е р 1. Хнмотрипсинолиз бычьего сывороточного альбумина проводят по следующей методике; 100 мкг белка растворяли 100 мкл дистиллированной воды и по каплям добавляли 100 мкл 0,2 М И-метил-ацетатного буфера до рН 8,1. После этого добав ют 2 мкг химотрипсина, растворив предварительно в 2 мкп дистилл ной воды. Пробирку закрывают п фипьмом и перемешивают при 37 чение 4 ч. После окончания химотрип 2(57) Изобретение относится к биохимии и касается способа выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле. Целью является повышение чувствительности при определении изоэлектрической точки пептидов с мол.м. ниже 10000. Способ осуществляется изоэлектрофокусированием пептидов в борат-полиольной системе в полиакриламидном геле, фиксацией и окрашиванием гелей в О, 1-0,15%-ном растворе бриллиантового голубого в 20-30%-ном метаноле, содержащем 3-7% глутарового альдегида и обесцвечивают в 0,3-0,5%-ном растворе глутаральдегида в 20-30%-ном метаноле. 4 ил., 1 табл. Стеклянные трубки с внутренним диаметром 4 мм и длиной 17 см помещают в виде пакета в химический стакан. Непрерывный линейный градиент рН создавали путем смешивания с помощью градиентного смесителя "1 егодгай" (ЬКВ швеция) в определенных концентрациях трис-боратного буфера рН 7,0, содержащего борную кислоту О, 1 1 (трис-Гидроксиметил), метил- амин 0,039 М, мочевину 6 М, смесь акрил-бис/акриламид (30- 1, 2) 5% и 55% раствора глицерина в этом же буФере, после чего его рН снижалось до 4,0 Проводят подслаивание перистальтическим насосом буферной смеси, начинал с самой щелочной, в химическийстакан. Заполнение проводят в термостате при Т = 25 С с последующей фотополимеризацией в течение 4 ч приТ = 20 С под действием 0,157. рибофла 5вина и 0,038% тетраметиленэтилендиамида,Изоэлектрофокусирование с цельюопределения количества пептидов после химотрипсинолиза бычьего сывороОточного альбумина проводят в течение26 ч. На щелочной торец столбика геля наносят 100 мкл пептидной смеси смол.в. менее 10000 Д. Стеклянныетрубки со столбиками геля подключаютк источнику постоянного тока при градиенте потенциала 30 В/см. Послеокончания изоэлектрофокусирования гели извлекают из трубок с помощью вакуумного насоса и окрашивают в одномслучае 0,1%-ным раствором кумассибриллиантовый голубой Кв 50%-номэтаноле и 107-ной уксусной кислоте вотечение 4 ч при Т = 20 С с отмыванием в 6%-ной уксусной кислоте в течеоние 4 ч при Т = 20 С с отмыванием в6%-ной уксусной кислоте, в другомслучае - 0,1%- ным раствором кумассибриллиановый голубой Кв 25%-номметаноле и 5%-ном глутаровом альдегио 30де в течение 4 ч при Т = 20 С с отмыванием в 25%-ном метаноле и 0,4%-номглутановом альдегиде.На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляется полоса сфокусированных пептидов, отсутствующая в известном способе (фиг. 1 а, б).П р и м е р 2. Изофокусированиепептидов после химотрипсинолиза аль-долазы с последующим отделением нафильтре РИ фракции пептидов смол.м. менее 10000 Д проводят в техже условиях, что и в примере 1, используя в фиксирующем красителе поданному способу глутаровый альдегид 45в концентрации 7%, а в атмывающем растворе - 0,3%.На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляются две полосы сфокусиро-, 50ванных пептидов при полном отсутствии полос в известном способе определения (Фиг. 2 а, б),П р и м е р 3. Изофокусирование55пептидов после химотрипсинолиза каталазы с последующим отделением нафильтре РИФракции пептидов смол.в.менее 10000 Д проводят в тех же условиях, что и в примере 1, используя в фиксирующем красителе поданному способу глутаровый альдегидв концентрации 37 а в отмывающем растворе - 0,3%,На основании сравнительного сканирования на лазерном денситометре гелей проявляются три полосы сфокусированных пептидов при полном отсутствии полос в геле по известному способу определения (фиг. 3 а, б).П р и м е р 4. Изофокусированиес целью определения количества пептидов после химотрипсинолиза бычьегосывороточного альбумина с последующимотделением на фильтре РИ 10 фракциипептидов с мол.в, менее 10000 Д проводили в тех же условиях, что в примере 1, используя в фиксирующем красителе по данному способу 0,15%-ныйраствор кумасси бриллиантовый голубой Кв 207-ном метаноле и 5%-номглутаровом альдегиде (фиг. 4 а) и0,15%-ный раствор кумасси бриллиантовый голубой Кв 30%-ном метанолеи 5%-ном глутаровом альдегиде(Фиг4 б),На основании сканирования на лазерном денситометре гелей показано,что использование в Фиксирующем красителе 0,15%-ного раствора кумассибриллиантовый голубой Ки. 20 и30%-ного метанола не ведет к изменению пенситограмм,В результате проделанной работыпоказано, что по сравнению с базовымметодом получены лучшие результатыдля определения изоэлектрических точек пептидов с мол.в. менее 10000 Д.По сравнению с другими методами изоэлектрофоретического разделения, такими как изоэлектрофокусирование в .амфолитах различных фирм (алфолиныфирмы 1.КЕ Бвеция, сервалиты фирмыЯегча ФРГ, биолиты фирмы ВоКай США),предложенный способ дает существенные преимущества для определения низкомолекулярных пептидов, Амфолиты любой Фирмы близки по мол,м. и химическим свойствам к низкомолекулярнымпептидам и окрашиваются вместе с ними. Поэтому определение низкомолекулярных пептидов при разделении их вамфолитах невозможно. Предлагаемый способ позволяет определить изоэлектрические точки пептидов, в то время как прототип иэоэлектрические точки пептидов с1677599 Фигура Значения изоэлектрических точек 5,83 4,95 5,93 1 а 1 б 4,30 4,18 4,30 4,18 6,20 2 а 6,80 5,85 6,68 За 6,45 4 а, б 6 20 5,83 5,93 5,83 4,95 4,30 4,18 мол.в, менее 10000 не представляетсявозможным определить вообще (см. таблицу).Значения изоэлектрических точекпептидов, определенных в примерах,приведены в таблице,Формула изобретенияСпособ выявления пептидов при изоэлектрофокусировании в полиакриламидном геле путем фиксации геля, окраши вания красителем кумасси бриллиантовым голубым 11-250 и его отмывания,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения чувствительности приопределении изоэлектрической точкибелков с мол.м. ниже 10000, фиксациюи окрашивание геля проводят одновременно О, 1-0, 152-ным раствором краси- Отеля в 20-307.-ном метаноле содержаО ущем 3-72 глутарового альдегида и 0,30,52 его в отмывающем растворе1677599 Н Ч,О Составитель С.МельниковаРедактор Н.Ивыдкая Техред А,Кравчук Л.Обруча Корр За при ГКНТ СССР Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгор 01 Гагар 319 ТиражГосударственного комитета по113035, Москва, ЖПодписно зобретениям и открыт Раушская наб., д. 4