Способ получения l-валина

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК В ги аии М 14331976. ло пол- рый ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО ОМУ С ВИД=ТЕЛ Ь СТ(56) Патент Анкл. С 12 Р 13/О юл. МЗЗ следовательский технотут аминокислот , Г,Е. Аветисова, А.В. Ар арян(57) Изобретение относи г,я к микробигической промышленности и касаетсяучения аминокислоты-валина, котоможет быть использован в пищевой, хческой промышленности и медиц Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты-валина, который может быть использован в пищевой, химической промышленности и в медицине.Целью изобретения является повышение выхода продукта.Способ заключается в следующем.В качестве штаммов - продуцентов используют мутанты бактерий рода В гечЬастегоп 1, обладающие устойчивостью к гидроксамату-аргинина или устойчивостью к гидроксамату .-аргинина и одновременно к высоким концентрациям а-аминомасляной кислоты(АМК) в присутствии-лейцина,Примерами штаммов - продуцвнтов - валина являются следующие мутанты бактерий рода ВгечЬас 1 егощ. депонированные 1675327 А 12 Р 13/08//(С 12 Р 13/ 12 й 1:13) Целью изобретения являетеч повышение выхода продукта, Способ заключается в том, ч 1 о в качестве продуценгов-валича исп льзчют штаммы бактерии рода ВГЕч ЬЭСТЕГОГП, ОбЛада 1 щИЕ уетОйЧИВО- сть 10 кидроксдмэ 1 у 1-эргининд или устои- чивостью к гидроксамату-аргинина и одновременно к высоким конценграциям а-амичомагляной к 1 л".,лльМК) ь присутствии-лейцина Мутант-, 1 тс,:чиьые к гидроксамау -аргиникэ (ц 1 та лм ВКПМ В), накапливаю; ь 1 ул, рал 1.ной жидкости до 17 г/л-ва,и ,;, к утаи ы стойчив.ззгидросе а 1 аричлна и одноеосмепно к я. Спким коцечтоациям ЛЮК в прису.:Твин -лен : 1 э агаммы ВКПМ Ви ВГ,ПЫ В," - до 55 г/л.1 табл. во Всесоюзнои коллекции промышленных микг.оорганизмов: штамм В, бачок АА 52, зарегистрированчый год номером ВКПМ В: штамм В, ТЭчол 1 АЛ 53. ззрегистрированный под номером ВКПМ В; штамм В. Лачое АА 54, зарегистрированный под номером ВКПМ В Указанные штаммы получены генетихаселекционными приемами из штамма В, йачогп АТСС 14067 (коллекционный номер ВКПМ В),ПредлагаемыЙ способ при использовании мутантов бактерий рода ВгечЬас 1 егогп, устойчивых к гидроксамату -аргинина, обеспечивает выход-валинд дс 17 г/л. Конкретным примером такого му 1 ан 1 а является штамм - продуцент .-валина В Иачо 1 т 1 ВКПМ В, Испол.зоеание мутантов бактерий рода Вгечьэс 1 егопт. Устойчивыходновременно к гидроксамату -аргинина и к высоким концентрациям АМК в присутствии-лейцина, позволяет достигнуть уровня накопления-валина в культуральной жидкости по 55 г/л. Примерами таких мутантов могут служить штаммы - продуценты 1 -валина В. Лачигп ВКПМ 8-3714 или ВКПМ 8-3715.В качестве родительских штаммов для селекции используемых мутантов могут быть любые штаммы бактерий, относящихся к роду ВгечЬастегиа.Эффект увеличения продукции-валина может быть достигнут также в сочетании с другими известными мутациями, способствующими накоплению -валина в культу- ральной жидкости (например, в результате мутации недостаточности по-изолейцину).Конкретная схема селекции штаммов - продуцентов .-валина:АТСС 14067 (ВКПМ 8-42):(родительский штамм,продуцирующий до 2 г/л1-валина) мтагенез М-метилй -нитро-й-нитрозогуанидином (НГ) иотбор мутантов,нуждающихся в 1 -изолейцине для роста АА 50.-валина) мутагенеэ НГ иотбор мутантов,устойчивых кАМК (55 мг/мл) вприсутствии(ВКПМ 8-3714 и ВКПМ 8-3715) (иэолейциновые ауксотрофы, устойчивые к гидроксамату 1-аргинина и устойчи - вые к высоким концен 5 15 20 Г) 5 30 35 40 45 50 55 трациям АМК в присутствии 1-лейцина, продуцирующие до 52 - 55 г/лЕ-валина)Согласно предлагаемому способу в качестве штаммов - продуцентов -валина используют мутантов, устойчивых кгидроксама 1 у 1 -аргини,. а, Кроме того, в качестве ытаммов - продуцентоа 1-валина используют мутантов, усгоичивых к высокимконцентрациям АМК в присутствии-лейцина, т е, обнаружено, что высокая валинпрсдуцирующая способность достигается насредах с высокими концентрациями АМК(55 мг/мл) только в присутствии-лейцинавыход -валина у штаммов В,Начал ВКПМ8-3714 и ВКПМ Вповышаегся по отношению к исходному штамму от 17 до 52 -55 г/л.Штаммы В Лачоа ВКПМ 8-3711 ВК;1 М8-3714 и ВКПМ 8-3715 являются также мутантами, нуждающимися в 1-изолейцинедля роста, Мутации устойчивости к высокимконцентрациям АМК в присутствии-лейцина и к гидроксамату-аргинина и ауксотрофности по-иэолейцину мокнут бытьполучены с помощью мутагеиизации ба:; -терий любизвестным способом например, обраооткой НГ или ультрафиолетовымоблучением).Штаммы стабильно сохраняют свои генетические маркеры (устой ивость к гидрооксамату -аргинина, устойчивость ка-аминомасляной кислоте в присутствии 1.лейцина и ауксотрофность по-иэолейцину)и валинпродуцирующую активность в обычных условиях хранения, т.е, при посеве уколом в полужидкий агариэованный МПБ споследующим хранением под слоем ваэелинового магла как в холодильнике (4 - ВС),так и при комнатной темпера 1 ре в течение1 года, хранении посевом на скошенномМПА в холодильнике в течение 1 - 2 мес.Частота реверсии по признаку ауксотрофности по изолейцину у всех трех штаммов -продуцентов равна 1-3 х 10 , ревертантовпо остальным двум генетическим признакам в процессе 1,5-годовой работы с продуцентами не обнаружено.Штамь ы В. йачагп ВКПМ 8-3713, ВКПМВи ВКПУ 8-3715 имеют следующуюхарактеристику,Культурально-морфологические признаки,Клетки овальные длиной 1,7-2,5 мкм,бесспоровые, неподвижные, грамположительные,Мясо-пептонный агар, На 2-е сутки роста при 28 С колонии диаметром 3-4 мм,круглые с гладким краем, центр приподнятв виде конуса, поверхность гладкая, блестящая. цвет желтовато-кремовый.Штрих на мясо-пептонном агарв, На 2-е сутки рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная, цвет желтовато- кремовый.Рост по уколу в мясо-пептонном агаре умеренный, в основном на поверхности среды.Минеральная среда Гловера с глюкозой, Для роста необходим биотин, тиамин и-изолейцин На 2-г сутки роста при 28 С колонии диал 1 етрам " мм, цвет светла-кремовый. Рост штриха на 2-е сутки умерен ный, плотный, цвет све 1 ла.ремаоый.На картофеле рост и образование пигмента с желтым оттенком,Желатин не раэжижа ". г.Физиолого-бипхйми вские признаки, Отношение к источникам углерода, Хороший рост на глюкозе, сахарозе, мальтозз, фруктозе, манназе; слабее на галактоэе, рамнозе, сорбозе, сорбите, аммонийной и натриевой солях уксусной кислоты, этиловом спирте; не использует лактозу.Отношение к источникам азота: ассимилируют амманийный азот и мочевину,Голучение штамма Е Пачпп ВКПМ В.Штамм В. 1 ачогп ОТСС 140 б 7 выращивают в мясо-пептоинам бульоне (МПБ) при 30 С с аэрацией цп айаглкения титра 10 клеток/мл, Клетки стм лают о- л 4 П: центрифугированием и рес/спендирую в ц 1 тоатном буфере рН 5,5). К полученной суспенэии добавляют НГ до конечной к центрации 300 мк./мл, инкубирую 1 с аэра цией в течение 20 мин при 30 С, Затеги клетки отмывают от мугагена охлажденным МПБ, переносят в пробирку с 10 мл МПБ, инкубируют с аэрацией 18 ч при 30 С и затем рассеивают на среду ч. 1 састэва, мг/мл: глюкоза 20; Ма 504 2; К 2 НР 04 3; КН 2 Р 04 1; чН 4 С 3; КН 4 Оз 1; Мц 504 х х 7 Н 20 0,1, МпЗС 4 х 5.2 С 1 х 101; биоти;-5, -45 х 10; тиамин хларид 1 х 1 О,-Изалейцин 0,2; агар-агар 20; рН 7,4, Среди колоний, выросших на этой среде после 48 ч инкубации при 30 С, отбирают мутант, не способный к росту на среде М 1, которая не содержит-иэолейцин, Полученный изолейциновый ауксотроф, обозначенный Е. йачцт АА 50, вновь обрабатывают НГ и высевают на среду М 1, содержащую также гидроксамат-аргинина в концентрации 10 мг/мл. Колонии, выросшие на этой среде после 72 ч инкубации, расчищают и проверяют их валинпродуцирующую способность. Один из отобранных таким образом мчтантов, продуцирующий-валин, обозначен В, йачоа ВКПМ В,Получение штаммов В, Лачогп ВКПМ В 3714 и ВКПМ В,5 Штамм ВКПМ ВмутагенизируютНГ и рассеивают на среду М 2 следующегосостава, мг/мл: глюкоза 10; йа 2304 2;К 2 НР 04 3; КН 2 Р 04 1; МН 4 С 3 ИН 4 МОз 1;9 у 304 х 7 Н 20 0,1; МпЯ 04 х 5 Н 20 1 х 1 О10 еЬО 4 х 7 Н 201 х 10; биотин 5 х 10, тиаминхлорид 1 х 10; -иэолейцин 0,2;-лейцин-4,0,2; 4 МК; агар-агар 20, Выросшие колонии очищают и проверяют их валинпродуцио", ющцю способность в условиях калбочных15 ферментаций, Два из таких мутантов, продуцирующие повышенные количества 1-валина, обозначены как В.1 ачип ВКПМВ:и 14 и ВКПМ В,Посевной материал штаммпв - проду 20 центов для последующей ферментации може 1 быть приготовлен любым известнымспособам; таким, кэк выращивание на поверхности твердых агаризованных питательных сред в жидких питательных средах,25 содержащих у".вояемые источники углерода, азота, неорганические соли и органичегкие вещества обеспечивающие ростмикроарга лиз, -.вВ качестве игтацннков углерода могут30 быть испольэ:. мы .кие углеоды, как сахароза, глю:азл фрулпэа .;-л,таза, маннсзэ, крах.:лг, ги,.,п; лиза крахмала имелам.а; мн- сатамцые спирты, такие какглиц;рлн и саби-: . гэпические кислотытакие, как м"г.эвь ашная кислота. уксуснаякислота, л оочная кислота, фул 1 аравая кислота малеинавэя к"слота, прапионоваякислота; спирты такие как метанол и этанал, Указанные источники углерода могут40 бить использованы как в отдельности, так ив сочетании друг с другол 1 в различных весовых соотношениях. Общее количество исгочника углерода может быть введеновначале фермен 1 ации либо порциями в про 45 цессе ферментэцииВ качестве источника азота могут бытьиспользованы как органические, так и неорганические соли аммония, например сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат."0 аммония, ацетат аммония, нитрат аммония,фоефат аммония, лактат аммония, аммоний,мо:евина, различные природные азотсодержащие соединения, например пептон,гидролизат дрожжей, мясной экстракт и55 гидролиэаты растительных белков,В качестве неорганических солей могутбыть использованы фосфарнокислый калий.фосфарнокислый натрий, сульфат магния,хлорид ; атрия, сали:".елеза и марганца,карбонат кальция.В качестве органических веществ, необходимых для роста названных штаммов, могут быть использованы тиамин (например, вформе гидрохлорида или бромида), биотинили его заменители (например, дестиобиотин, биоцин, 7,8-диаминопеларгоновая кислота), а также аминокислоты, если о гинеобходимы для роста микроорганиэмоеьнапример 1-изолейцие, При условии нал,чия органических веществ в достаточном количестве в сос 1 аве др/гих компонентовпитательной среды необходимость внесе.ния таких органических веществ в чистомвиде отпадает,Ферментационная среда содержи 1,: /л;Сахароза или глюкоза 100 -200Сульфат аммония 0-80Сульфат магния 05 ОКалий фосфорнокислый одноэамещенный 05 10 О1-иэолейцин 0,1- 1"4а также сульфат железа, сульфат марганца,биотин, тиамин. Накопление 1-валина наблюдается через 6-8 ч после начала ферментации. Однако максимальный уровень 251-валина в культуральной жидкости достигается в результате полного потребленияисточника углерода ч;нергии (через 26 ч 4более после начала ферментации в зависимости от использованной концентрации источника углерода и энергии).Одновременно с валином в культуральной жидкости ,акапливается ряд амине.кислот, Содержание аминокислот вкультуральной жидкости штаммов-вредуцентов В. 11 ачпгв ВКПМ Ви ВКПБВприведено в таблице,Содержание 1-валина в культуральнойжидкосги и других растворах определяют спомощью метода бумажной хроматогоафиии окрашивания нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора.Накопленныи 1-валин может быть выделен иэ культуральной жидкости люба.м известным способом, там как удаление 45микроорганизмов и других нерастворенныхчастиц центрифугированием или фильтрацией, адсорбцией 1-валина на ионообменные смолы с последующими элюированием,концентрированием и кристаллизацией 1. 50валина.П р и м е р 1, Посевной материалштамма В, йапщ ВКПМ Вготови следующим образом В пробирки, содержащие10 мл стерильного МПБ (рН 7,5) асепти е 55ски вносят петлей культуру, выращенную наповерхности МПА. пробирки инкубируют накачалке в течение 16 ч,В ферментациснные колбы о;:ьемом500 мл асептически разливают по 15 мл про. стеризированной ферментационной средыили следующего состава, г/л, сахароза 150;-изолейцин 0,25; рН 7,В колбы вносят по 1 мл посевного матеи ала з.,-чма 1 ЗКПМ Ри инкубируютна качалка (220 об/4 ин) в, ечение 96 ч при30 С, Содержание 1-валина в культуральнойжидкости, полученной после завершенияферменации "5г/л250 мл полученнои культу,.альной жидкоди, сд 1 еожэщей 13,8 г валина, цензри,; ируют ".00 об/мин е течени 20 мин) дляуаления бэктерий и других неоэстеоримыхчастиц Получе.ный супернэтлнт поопуска.ю чеоеэ коле н 1 щ с ионообменной смолой в+Ь Форм в направлении снизу- вверх соскорость о 0,6 обьемов раствпрэ ня 1 обьемсмолы эач, Колонну промывают водой нэйируют адеорбированный 1:вали 3,5- нымводным паствсоом аммиака. Полученныйэлюа- концентрируют под вакуумом до появле ня криселлов и дальнейшую кристаллиээциго 1-валид;д осуществляют при 5 С в-е,ение,. ч Кристаллы очеляют от раство.виг:,:, 1 вэ;";4 ь дрез Гумажнй фильтр1 сушат:, эдак,умом. В ход 1-валина сов,валяет ,7 г бе учла его содержан,я вматочном - .стдл,1 е, что даетобщий выходот цержэил в кулд,дуральной жидкостиГ 31 иетота прод к;а по,анцд; бумажнойхрома 1 оггафии 96,6),.П р н и в;. 2, Ппоцесс п доводят аналогично прим.;ру 1, только в качестве прсдуцента 1-валина используют штамм В. бачивВКПМ В, а концентрацию сахароэыв ферментационной среде берут равной120/л Содержание 1-валина в культуральной жидкости после 72 ч инкубации составляет 41,7 г/л,П ." и м е р 3. Процесс проводят аналоги сно примеру 2 только е качестве продуснтл 1-в. лина ис ольэую",штамм В, ИацаЦКПМ =.с 15 Содержание 1.валина в .ультуральнЛ жидкости по,.ле 72 ч инкубациисоставляет 43,5 гл,П р и,д е р 4 Процесс пооводят аналогично пример, 1 только в качестве продуце гэ 1-валина 1 сп. ьзуют штамм В, Иаощ БКП," В ":д 71 Выход 1-валина составляет 52,7 г/л,П р ; м е р 5, Процессроводят аналогично примеру 1, только в качестве проду. цента 1.валина используют штамм В. Лачцгл ВКПМ Б, Содержание 1-валина в кульгуралы. эй жидкости 17,2 г/ь10 1675327 орректор Э.Лончако едактор И.Дербак Техре ргентал каз 2976 Тираж По ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям 113035, Москва, Ж, Раушская на ., дписноеи открытиям при ГКНТ Сб 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина П р и м е р 6, Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве ферментационной питательной среды используют среду следующего состава, г/л: меласса 220; гидролизат БВК (паприна) 80; КН 2 РОд 1; 504 20; мел, 5. Выход 1-валина у штамма ВКПИ В24,8 г/л, а штамма ВКПМ В26,7 г/л.Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно повысить выход продукта и снизить его себестоимость,Формула изобретения Способ получения-валина, предусматривающий выращивание микроорганизма -продуцента из рода Вгеч 1 Ьастегцгп в условиях аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые факторы.5 до максимального накопления целевогопродукта с последующим его выделениемиочисткой, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода продукта, в качестве микроорганизма - проду цента из рода Вгеч 1 Ьастегнписпользуют штамм Вгеч 1 Ьастег 1 цп йачцт ВКПМ В.3713 или ВКПМ В, или ВКПМ В.