Способ определения лизоцима в биологической жидкости

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1675328 А 19)гп)5 С 1/34 ГОСУДАРСТВЕН.ЬИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Харьковский научно-исследовательскийинститут микробиологии; вакцин и сывороток им. Мечникова и Харьковский научно-исследовательский институт эндокринологиии химии гормонов(53) 577, 15. 08(088,8)56) Оззегп 1 ап Е,Г.,апог О,Р, Яегцгп апдОгпагу узогуп)е (Могагт таззе) п МопосутсапО Мопогпуеоскс Мета, - ,оогпа о 5Ехреггпепта Мейспе, 1966, У, 124, М 5,р. 921 - 952,Мотавкина .,СКовалев Б.М., ШароновА.С. Микрометод количественного определения лизоцима, - Лаб, дело, 1979, М 12,с. 722-724,Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской микробиологии.Целью изобретения является повышение чувствительности способа.Способ заключается в использовании твердой гелевой среды, в состав которой наряду с тест-культурой Мсгососсоз узобеттсоз входит 5,2-6,5 гидрогель трехмерного полиакриламида. указанная среда, сформированная за определенные промежутки времени, имеет хорошие диффузионные свойства, что позволяет выявлять низкие концентрации лизоцима в исследуемых жидкостях.Оптимальные дозы акриламида, а также временные параметры формирования гидро(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИЗОЦИМА В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ(57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской микробиологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Способ заключается в том, что обнаружение лизоцима осуществляют путем диффузии его в гелевой среде, сп-ержащей 5,2-6,5;ь трехмерного геля поизкрил,мидэ и 1 ест-культуру Мсососсоз уз. ое".:1 сцз Концентрацию лизоцил а определ.:ют путем сравнения раэмерс в эо лизиса с зонами лизиса, полученнь;л 1 и с испочьэоанизм стандартных растворов лизоцима. Чувствительность метода 0,1 мкгмл при о.,ьеме пр;бы 0,003 мл.4 табл,геля определены экспериментальным путем с помощью изучения физико-химических свои" тв смеси и обнаружения пороговых значений активности лизоцима.Акриламид берут в разведениях от 5,0 до 6,7;ь. Время загустевания всех образцов одинаково и составляет не менее двух минут (минимальное время формования смеси),Оценку оптимальных концентраций полиакриламида проводят по степени прочности консистенции сред, диффузионной способности их и возможности образования одинаковых по обьему лунок, Эти показатели характеризуют плотность геля, пригодность его в исследовании жидкостей, что относится к обязательн.л 1 условиям постановки данного теста.Диффузионная способность гельсреды определена с помощью стандартного раствора лизоцима, взятого в концентрации 8 мкг/мл. Плотность оценена по величине зон лиэиса вокруг лунок, заполненных раствором фермента,Характеристика гидрогеля с различной концентрацией полиакриламида (время формирования среды 2 - 5 мин) представлена в табй. 1.Смеси, содержащие 5,0 - 5,17 ь полиакриламида (ПААГ) имеют мягкую. непрочную консистенцию, Формирование лунок затруднего и сопровождается разрывами среды. Это придает им неправильную форму- в виде различных по вытянутости эллипсоидов. Такое некачественное образование лунок препятствует точному измерению зон лизиса.Образцы, содержащие полиакрилвмид в количестве 5,2-6,50 , имеют достаточно прочную консистенцию, в то же время формирование лунок не вызывает затруднений. а зоны лизиса являются четкими и хорошо выраженными.Увеличение до излучаемой составной (6,6-6,7) приводит к повышению плотности смеси: эоны лизиса оказались меньшими на 4-5 мм, образование лунок нередко сопровождается разрывом среды,Следовательно, низкие(5,0 - 5,1;) и более высокие(6,6 - 6,7=,ь) концентрации ПААГ не позволяют получить с заданными свойствами гель. Основным физико-химическим требованиям отвечают образцы, содержащие 5,2-6,57 ь указанного компонента смеси. Приведенные результаты согласуются с материалами изучения чувствительности теста.Частота выявления различных концентраций лизомина в стандартных растворов представлена в табл, 2,Как следует из табл, 2, применение образцов гельсреды, содержащих 5,2-6,5 мас. полиакриламида, позволяет в 96,0- 100.0 случаев выявить минимальные концентрации фермента (0,1 мкг/мл). Чувствительность теста при добавлении в смесь 6,67 ь ПААГ снижается. С помощью этих образцов гельсреды лизоцим в дозе 0,1 мкг/мл обнаруживается в 25,0 случаев.На чувствительность теста влияют как различные концентрации ПААГ, так и время сшивки гельсреды (табл. 3). Минимальная продолжительность (2 мин) и последующие временные интервалы образования геля (до 15 мин) не вызывают снижения разрешающей способности данного теста, Однако более длительное (16-20 мин) загустевание 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реакционной массы изменяет чувствительность предлагаемого метода - пороговая доза лизоцима увеличивается в 2 раза, а частота положительных результатов при содержании фермента 0,1 - 0,25 мкг/мл оказывается в 3,1 - 5,0 раза ниже.Таким образом, оптимальным содержанием полиакриламида в среде является концентрация его 5,2-6,5 ф а время формирования еля - от 2-х до 15-;и мин,Способ осуществляют следующим образом,Приготовление гельбактериальной сре. ды,В 1/15 М фосфатный буфер(рН 6,2) вносят акриламид (АА) и М,М -метилен-бис-акриламид (МБА) (0,2 - 0,250), ггобы получить 5,2 - 6,5-,ь-ный рас; нор суммы эти комг онентов в конечной реакционнои смеси, и й,й,М,М -тетраметилэтилендламин (ТМЭД) (0.1-0 3 Ж)Навеску сухой культуры М. 1 увоЛейтсцэ (из расчета 0,1-0,15 к обьему среды) тщательно растирают с несколькими каплями буфера, переносят в предыдущий раствор с помощью небольшого количества буфера и перемешивают,Отде,;ьно в небольшс.1 количестве буфера ( = /5 его общего обьема) растворяют навеску калия персульфата (ПСК) (0,08 0,15 ) и добавлякп к ранее полученной суспенэии,Суспенэию выливают на подложку, которой может служить предметное стекло, дно чашки Пери, любав с 1 еклвнная или полимерная пластинка (иэ расчета 0,2 мл среды на 1 см площади)2Время формирования геля составляет 2-15 мин. Пластины с готовой средой можно разрезать на полости различных размеров, которые затем помеща 1 ь в чашку Петри и испольэовать по мере надобности.Затем гельпробойииком диаметром 2 мм делают лунки на расстоянии не менее 1 - 2 см друг от друга,Опоеделение лизоцима в биологической жидкости,Испытуемые г 1 рс: и количестве 0,003 мл вносят в отдельные лунки с помощью пастеровской пипетки с оттянутым концом или шприцем с иголкой для иньекций, предметные стекла помещают на дно чашки Петри и инкубируют в термостате в течение 24 ч, после чего измеряют диаметр зон лизиса вокруг лунки и с помощью калибровочной кривой определяют содержание лиэоцима (в мкг/мл) в испытуемом образце жидкости.С целью посгроения калибровочной кривои для каждой новой серии среды измеряют эоны лизиса тест-культуры микрококка вокруг лунок, содержащих стандартные разведения (0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0;4,0; 8,0 мкг/мл) кристаллического лизоцима.Способ определения лизоцима иллюстрируется следующими примерамиПример 1, В 70 мл 1/15 Мфосфатного буфера с рН 6,2 растворяют 5,0 г акриламида, 0,2 г МБА и 0,3 мл ТМЭД, Навеску0,145 г сухой культуры М. узобеИсиз растирают в ступке с несколькими каплями буфера и смывают 6 мл буфера вприготовленный раствор, Туда же добавля/ ют раствор 0.12 г ПСК в 14 мл буфера. Смесьрастворов перемешивают и разливают по 4мл на предметные стекла. Через 2 мин (время формирования среды) делают по 4 лункина каждом предметном стекле.Для построения калибровочной кривойготовят стандартные растворы, Предварительно растворяют 10 мг лиэоцима в 50 млдистиллированной воды (200 мкг/мл). Затем получают раствор с концентрацией8 мкг/мл (к 2 мл взвеси добавляют 48 млдистиллированной воды).Для приготовлении растворов с концентрацией 1,0; 2,0; 4,0 мкг/мл берут соответственно 0,25 мл рабочей суспенэии,содержащей 8 мкг/мл фермента, и 1,75 млдистиллированной воды; 0,5 мл взвеси+ 1,5 мл воды; 1,0 мл рабочего раствора+ 1,0мл воды. Более низкие концентрации фермента (0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл) готовятпутем разведения стандартного раствора с1 мкг/мл лизоцима (0,1 мл + 0,9 мл дистиллированной воды; 0,25 мл первого+ 0.75 млводы; по 0,5 мл раствора и воды),Стандартные растворы лиэоцима закапывают в лунки (по 4 лунки на каждую дозу),стекла,инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37 С, после чего измеряют зонылизиса, высчитывают их среднюю арифметическую величину, строят калибровочнуюкривую на миллиметровой полулогарифмической бумаге, откладывая средние значения диаметров эон лизиса каждогостандартного раствора по оси ординат, аабсолютные значения концентрации взятыхрастворов (в мкг/мл) по оси абсцисс,Исследуемую пробу ликвора, взятого от больного острым серозным менингитом, по 0,003 мл вносят в 2 лунки, предметное стекло кладут на дно чашки Петри и инкубируют при 37 С, Через 24 ч измеряют диаметры зон лиэиса. Зона лиэиса тест-культуры М, ЕузоОектсцз вокруг каждой из двух лунок с исследуемой пробой ликвсра равняется =4,5 мм, По калибровочной кривой это со 5 ".0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ответствуетО,1 мкг/мл,П р и м е р 2. Готовят гельсреду, содержащую 6,57 ь ПААГ со временем сшивки 15 мин, Для этого берут следующие количества ингредиентов, необходимых для приготовлении среды: АА 6,25 г;МБА 0,25 г, ТМЭД 0,1 мл, ПСК 0,08 г, сухой массы микроокка 0,145 г, буфера 88,8 мл (93,2 г), Все операции проводят описанным в первом примере способом,Исследуют порцию мочи больного менингококковым менингитом. Величина зоны лизиса М, узобеЖ 1 соз вокруг лунки с исследуемым образцом составляет 8 мм, что соответствует концентрации лизоцима 0,25 мкг/мл,П р и м е р 3, Раствор технического гкриламида имеет рН 7,8 и содержит 8,0=,ь акриламида.Растсор 1, К 1 л укаэанного раствора прибавляют 14,8 г дигидрофосфата калия КН 2 РОд и 4,35 г гидрофосфата натрии Ма 2 НРО 2 Н 10, хорошо перемешивают и фильтруют Получают раствор, имеющий рН 62,Раствор , В 95 мл раствооа 1 растворяют 0,38 М,И -метилен-бис-метакочламлда и 0,25 мл Т,ЛЭД.Раствор , В 10 мл фосфатного буфера растворяют О, )65 г калия персульфата.Растворыисмешивают со взвеселю 0,18 г тест-культуры в 11 мл буферного раствора и выливают на предметные стекла, либо в чашки Петри, либо в гооиэонтальную форму иэ оргстекла, Через 5 мин образ 1 ется гельбактериальная смесь, которая содержит 6,5;ь полиакриламида и 0,15 тест- культуры,Исследуют пробу жидкости, взятой с помощью катетера из пред" тательной железы, Добавление биологического субстрата в гельсреду сопрочождается образованием зоны лиэиса диаметром 8 мм, что соответствует концентрации лизоцимэ 0,25 мкг/мл,Сравнительные данные применения известного и данного способов были получены при обследовании 35 больных острыми аерозными менингитами вирусчой и бактериальной этиологии, Лизоцимную активность спинномозговсй жидкости определили у всех больных, в том числе у 27 иэ них параллельно изучили содержание феомента и в моче (табл, 4). концентрации лизоцима Формула изобретения Способ определения лизоцима в биологической жидкости с помощью метода диффузии в гелевую среду с использованием тест-культуры Усгососсцз узобейтсцз и1675328 оценкой концентрации лиэоцима по размеру зон лиэиса тест-культуры, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве гелевой среды исполь 9 уют полиакриламидный сшитый гель с концентрацией 5,2 - 6,57 ь и продолжительностью формирования геля 2-15 мин,5 Таблица 1 Из них имели свойства Концентрацияполиакриламида,оличе сто образДиффузионные (позонам лизиса вмм) Физи 1 . ские цов Прочные Не про чнь 1 е Формиров ание лунок10-12 13-14 15 и не заз атруднено труднено Таблица 2 Частота обнаружения,7, лизоцима при его конце н т рации (н мк г/мл) Количе ство образцов Содержание полиакриламида вгельсреде Х О, 05 0,1 0,25 0,5 1,0 20 100 100 100 26,0 98,0 1 ОО 100 30,0 96,0 100 100 0 25,0 45,0 100 100 100 100 100 50 50 40 20 5,2 5,8 65 о,б 5,С 5,1 5,2 5,3 5,4 55 56 5,7 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 6,3 6,4 6,5 6,66,7 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 0 0 0 0 0 0 0 0 О О О 0 0 0 0 0 Г) 1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 0 0 0 0 0 0 О 0 0 О 0 П 0 5 0 1 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 2 0 0 0 0 0 О 0 О О О О 0 (1 0 О 3 4 0 0 0 0 0 0 l О 0 0 0 0 1 1 1 5 ,5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 4 1 010 1675328 Т а б л и ц а 3 Частота обнаружений, Хз лизоцима при его концентрации (в мкг/мл) "Г"( КонцентВремя сшив к Количе ство об- разцовз рация полиакриламида, Ж сред,мин0,5 5,2 6,5 табпицаа Биологи- Копичестчссная во проб Способопредепенияпизоцниа Из них с попоаитепьон чисп/ип) изоцю резупьта ность вс 0 г 5 Э 7,а 6,редпа аеьюй Лис в ноча ставитель А.Семеновхред М,Моргентал Корректор Э,Лончакова дактор Г.Наджарян Заказ 2976 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рвушская наб., 4/5 роиэводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 2-56-1011-1516-2 О2-56-1011-1516-202-56-1011-1516-20 25 25 25 25 25 25 25 25 95 2 25 100 100 100 24,0 100 100 96,0 20,0 100 100 96,0 12,0 100 100 100 36,0 100 100 100 32,0 1(О 100 1 ОО 20,0 100 100 100 88,0 100 100 100 92,0 100 100 100 84 зО 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100