Металлопротеиназа

СОЮЗ СОЕЕТСНИХ СОЦИАЛИСТИЧ ВСКИХРЕСПУБЛИК 1)5 С 12 НУ,ОТВ зиологии 1. ВосЬеш,.977, р, 298"(57) .Из нологии сается ческого нение в ся к биотехно" ологйи, као Фермента,ическим Фер- рименение в ан, ожогов,и для полунолу- ющего ыделения,фермент,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОВ ЕТЕНИЯМ И ОТНРЫтИЯМПРИ ГКНТ СССР Н ДВТОРСНОМУСВ(71) Институт биохимии имикроорганизмов АН СССР(56) Зсерапоч Б.М, ес аВ 1 орпуз. Вез. Сопшщп. 1305 Алексеева В.В. Получение гомоген-. ной нейтральнойбактериальной проте" иназы ВасШпз зиЬй 111 з - шт. 103 и изучение ее свойства, Автореф. дис. на соиск. учен. степени кан.техн, на уке - М.3 ИГИММП, 1977,. АЛЛОПРОТБИНАЗАбретение относится к биотеха именно к энзимологии, ка получения нового протеолитифермента и может найти прим медицине при лечении ран,Изобретение относитлогии, а именно к энзимсается получения новоготносящегося к протеолитментам и может найти пмедицине при лечении рдругих повреждений кожичения культуры клеток,Целью изобретения являетсячение нового Фермента, обладатаким комплексом свойств, которыйза счет простого способа впозволяет получить дешевый ожогов, других повреждений кожи идля получения культуры клеток. Цельюизобретения является получение нового фермента и удешевление его за счет.простого способа выделения. Металлопротеиназа, выделенная из бактерийХапсошопаз зр. ВКМ В, обладающаяпротеолитической активностью и имеющая следующие свойства: активностьгомогенного фермента 10,5 ТЭ/мг белка, молекулярная масса 28000+2000(при определении методом гельфильтрации на сефадексе С = 75), оптимуммолярности 001-0,05 М, оптимум температуры, реакции 60 С, оптимум рН 8,термостабильность в . активность падает с 50 С, константа Миказлиса3,2 мг/мл (субстрат - казеин), ингибиторы - ЭДТА (15 х 10 М) на 953, неингйбируется ингибиторами сериковыхи тиоловых протеаз, катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибироваиия ЭДТА. 6 табл. Изобретение заключается в том, что бактерию Хапйоаопав зр. ВКМ Ввыращивают на питательной.среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, а целевой продукт. выделяют из культуральной среды известнымн методами.Из известных методов могут быть использованы дробное освоение ацетонов ном, фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-сеФадексе и хроматографию на сефадексе 0"75.15942Полученный фермент является электрофоретически гомогенным и имеет следующие характеристики: мол,м,28000+ +2000 (при определении методом гель- фильтрации на сефадексе 0-75), оптимум молярности 0,01-0,5 И, изоэлектрическая точка 5,0 (при определении методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле и носителе ти па амфолин с интервалом рн 3"10, оп" тимум температуры реакции,60 С, оптимум рН 8,0 (в трис-НС 1 буфере при 37 бС субстрат - казеин), термоста"Уобильность при 40-46 С в течение 15о 15 мин 1007., активность падает с 50 С (в трис-НС 1 буфере при рН 8,0), при 60 С - до. 507. (условня те же), константа Михаэлиса 3,2 мг/мл (субстрат - казеин), ингибиторы " ЭДТА (5 х 10 И)3 на 957, не ингибируется ингибиторами сериновых й тиоловых протеаэ, в частности диизопропилфторфосфатом (5 х 10 М), катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ее ЭДТА.П р и м е р, В колбу емкостью 750 мл вносят 100 мл питательной среды состава, г/л:Глюкоза 10, 0 30Бактопентон 5,0БВК 3,00НаНРО х 12 Н 0 1,50КНРО 4. 0,35М 804 х НдО Оу 3535ГеБО 4 х Н О О, 05БаС 1 0,35Доводят рН среды до 7,0 раствором ИаОН, среду стерилизуют. В колбу вносят клетки культуры продуцента Хапошопаэ зр. ВКИ Вдо 5 Е и культивируют в течение 20 ч при 30 + 1 С на качалке (200 об/мин), Бактериальные клетки отделяют цент- рифугированием при 3000 об/мин на центрифуге К. Для выделения металлопротеиназы фильтрат культуральо ной жидкости охлаждают до 4 С и проводят. дробное осаждение ацетоном, К 1 об. (5 л) фильтрата культуральной жидкости добавляют охлажденный до 4 С ацетон, выдерживают 1 ч набхолоде, осадок отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют ацетон иэ расчета 1,5 об. ацетона55 на, 1 об. исходного Фильтрата культу- ральной жидкости, выдерживают 1 ч на холоду. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 0,5 л дис 14 4в тиллированной воды и проводят осаж" дение белков сульфатом аммония. К раствору Фермента добавляют серно- кислый аммоний иэ расчета 60 насыще- ния, перемешивают 1 ч, осадок отделяют центрифугированием. К супернатанту добавляют сульфат аммония до 803 насыщения, оставляют на ночь и определяют осадок при 13000 об/мин на центрифуге К. Осадок раство" ряют в 5 л дистиллированной воды, диалиэуют против дистиллированной воды, а затем - против 0,05 И трис-НС 1 буфера, рН 8,0. Ратсвор металлопротеиназы в 0,05 М трис-НС 1 буфера (рн 8,0) наносят на хроматографическую колонку (5 х 60 см), заполненную ДЕАЕ сефадексом Аи уравновешенную тем же буфером. Элюирование фермента проводят градиентом концентрации хлористого натрия от О, 02 до О, 3 М. Фермент элюируется с колонки при концентрации хлористого натрия 0,13 И. Фракции (150 мл), соответствующие активности Фермента, собирают и концентрируют, диализуя раствор Фермента против сухого полиэтиленгликоля мол,м. 20000. Сконцентрированный раствор фермента (3 мл) наносят на хроматограФическую колонку (2,5 х 80 см) с сефадексом С(тонкий), уравновешенным О, 1 М трис-НС 1 буфером, рН 7,5. Элюирование фермента проводят тем же буфером. Фракции, соответствующие активности фермента, объединяют, концентрируют диалиэом против полиэтиленгликоля. Фермент хранят замороженным при -40 С или в лиофильноо высушенном состоянии при -4 С. Протеолитическую активность определяют согласно известному методу в некоторой модификации по степени гидро- лиза казеина. Для этого к 1 мл 17-ного раствора казеина добавляют 1 мл 0,1 М трис-НС 1 буфера, рН 8;0 и 0,5 мл раствора Фермента. Смесь инкубируют при 37 С до 20 мин и реакцию останавливают добавлением 1,5 мл 157-ной трихлоруксусной кислоты, отфильтровывают осадок и определяют поглощение при 280 нм на спектрофотометре "СФ, За единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента, которое при 37 С в течение 1 мин освобождает 1 мкг-эквивалент тироэина (ТЗ).Термостабильность фермента определяют, выдерживая раствор фермента(4 мкг/мл) в течение 15 мин при различных температурах (табл. 4). Затем раствор охлаждают до 37 С и0,5 мл раствора фермента добавляютв реакционную смесь для определенияостаточной активности.Для определения зависимости активности фермента от температуры к1 мл 13-ного раствора казеина добавляют 1,0 мл О,М трис-НС 1 буфера,рН 8,0, выдерживают 20 мин при различных температурах и затем добавляют раствор фермента (0,5 мл) и смесьвыдерживают от 5 до 20 мин в зависимости от температуры (табл. 2).Определение изоэлектрической точки фермента проводят по известномуметоду, используя амфолины фирмы ЛВКс областью рН 3-6 и 3-10. Изофокусировку ведут в столбиках полиакриламидного геля при 1-2 мА на трубкув течение 3-3,5 ч. После окончанияизофокусировки гели извлекают изтрубок, разрезают на 30 ч., каждую 25часть заливают 1 мл О, 1 М хлористого натрия и оставляют на ночь. Затемв каждой пробе измеряют рН, активность фермента.Для определения константы Михаэлиса используют концентрацию казеинаот 1 до 16 мг/мл при концентрацияхфермента О, 66; О, 8; 1,3 мкг/мл.Ингибирование активности фермента,определяют, инкубируя раствор фермента с ингибитором в концентрации 5"10 М в течение 30 мин при 37 С, азатем 0,5 мл раствора фермента с ингибитором вносят в реакционную смесь.Молекулярную массу фермента определяют двумя методами - гель-фильтрацией и дискэлектрофореэом, Для определения молекулярной массы фермента гельфильтрацией хроматографическую колонку (2,5 х 85 см) с сефадексом С(тонкий) уравновешиваютО, 1 М трис-НС 1 буфером, рН 7,5, хроматографию ведут в том же буфере,используя в качестве маркеров бычийсывороточный альбумин (67000), овальбумин (43000), химотрипсиногенА(25000), цитохром (12400).Определение гомогенности и молекулярной массы фермента проводят методом дискэлектрофореза в 107-номполиакриламндном геле в присутствиидодецилсульфата натрия, В качествемаркеров используют те же белки,что и в случае гельфильтрации,4 бВыход гомогенного фермента составляет 3,97. от его содержания в культуральной жидкости. Активность гомогенного фермента 10,5ТЭщчмг белка Полученная таким способом металлопротеиназа является электрофоретически гомогенным ферментом и имеет следующие характеристики:Мол.м. 28000+2000Оптимум рЙ(табл. 2), СОптимум молярности (табл.3),М 0,01-0,05Фермент стабилен (табл. 4)до температуры, С ,50Константа Иихаэлиса (субстрат - казеин),мгмл 3 2ИнгибируетсяЗДТА, М 510Катионы двухвалентных металлов восстанавливают активность фермента после ингибирования ее ЭДТА и по этой способности образуют ряд:2+ аф г+ а+ 2+ 2+ Са , Со , МВ , Зг , Мп , Епг+Ва , Сс 1 (табл, 6).Фермент не ингибируется ингибиторами сериновых и тиоловых протеаз (табл. 5). Формула изобретения Металлопротеиназа, выделенная иэ бактерий ХапСощопаз зр. ВКМ В, обладающая протеолитической активностью и имеющая следующие свойства: мол,м. 280002000 (при определении методом гельфильтрации на сефадексе Соптимум молярности 0,01-0,05 М, изоэлектрическая точка 5,0 (при определении методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле и носителетипа амфолин с интервалом рН 3-10, оптимум температуры реакции 60 С, рН оптимум 8,0 (в трис-НС 1 буфере при 37 С, субстрат каэеин), термостабильность - активность падаетТ аблица 1 Определение зависимости активности металлопротеиназы от рН рН 65 70 75 80 85 90 Активность 10 , ТЗ/мп 1,37 1,68 1,88 2,43 2,21 1,74 Таблица 2Определение зависимости активности металлопротеиназы от температуры Темпе- ратура, С 22 25 ЗО 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 Активность10,ТЗ/мл 0,95 1,77 2,70 3,87 4,92 7,08 9,25 1174 15,16 10,83 8,33 6,00 3,33 ТаблицаЗОпределение зависимости активности металлопротеиназы от молярноститрис-НС 1 буфера, рН 8, ОВ Концентрация, моль 0,01 0,10. 0,20 0,30 0,05 О, 025 Активность 10 ТЗ/мл 1,82 1,62 1,62 1,99 2, 10 Таблица 4Определение стабильности металлопротеиназы Температура, фС 27 32 37 40 46 50 55 60 Активность 10 , ТЗ/мп 3,3 3,3 З,З 3,1 3,1 2,7 2,4 1,1 0,1 0 1594214 8 с 50 фС (в трис-НС 1 буфере при рН 8,0) (510 И) на 95%, не ингибируется ин- .40-46 С в течение.,15 мин - 1003,гибиторами сериновых и тиоловык проо60 С - до 5 ОХ (условия те же), кон- теаз, катионы двухвалентных металстанта Йихазлиса 3,2 мг/мл (субст лов восстанавливают активность феррат - казеин), ингибиторы - ЭДТА мента после ингибирования ее ЭДТА.1594214 9 Таблица 5 Влияние ингибиторов на активность металлопротеиназыИнгибитор гибивание, Х Конце ингиб тивностьТЗ/мп нтроль ДИ ФЮФ пХМБ ЗДТА им а аб лица 6еиназы катионами осстановление адвух ивности металл апентных металл а+ 2 з+ В а+ С,1 г+ 2 п Ва 24 ио Восстановение акивности 3 4,0 23,0 17,О 13,2 12, 9,оставитель И.Приваловаехред А.Кравчук . Корректор 0 Вщл актор Н,Р 14 Тираж 480 Подписное осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Зак зводственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 1 5 ф 10 5 ф 10 5 10 5 1 О 2,53,03,20,25 е. ДИФ - диизопропилфторфоФИСФ - фенилметилсульФоФторид пХМБ -, хлормербензоат, ЭДТА - натриевсоль зтилендиаминтетрауксуеной кислоты.