Способ получения ферментов 1. 4. 1. 3, 1-глутамат: ад( )+ оксиредуктазы и 1. 4. 1. 4, 1-глутамат: ад( )+ оксиредуктазы(дезаминирующих)

СОЮЗ СОВЕТСКИХсОцИАлистическиРЕСПУБЛИК 9) Я( ) (11 З,51 С 12 6 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБРЕ ОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ О ститут био(21) 3357968/28-13 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ (22) 19. 11. 811,4.1.3, 1. ГЛУТАМАТ:МАО(Р)+ОКСИДОРЕ- . (46) 30.09,83.Бюл. н 361 ДуктАзы и 1,4. 1.4, -ГлутАНАт;нАО (72) А. В. Софьин, Л. П, ЛосеваР -ОКСИДОРЕКТАЗЫ (ДЕЗАМИНИРУЮЩИХ) и В. РШатилов путем экстракции одноклеточных зе(71) Ордена Ленина ин хи- . леных водорослей фосфатным буфером мии им. А. Н. Баха с последующим фракционированием (53) 577,15 (088.8) .экстрактао т л и ч а ю щ и й с я (56) 1. ецпд Н.Т.,Тцгпег К., Ваз-Г тем, что,с целью ускорения способа и совЬВЬсЬвйс й,й. Рцг 111 сас 1 ол ос увеличения выхода каждого фермента, ап апвоп 1 цппдцс 1 Ь 1 е дцсапасе Ье- в экстракт добавляют хлористый йцдгодепазе ак сне цве о 1 сз апс 1- марганец до конечной концентрадеп аН 1 п 1 Су со 1 цеп-рцг 11 ед апС 1 Ьо" ции 0,025-0,030 М,осадок фосфата ду 1 п зрес 111 сгпецпоргес 1 р 1 сас 1 оп . марганца, сорбирующий 1,4.1,3,4.- + апд 1 пвцпоаЬзогрс 1 оп ргоседцгез.- глутамат: МАО (Р) "оксидоредукта" Апа 1 ус. В 1 осбеп ч, 110, 1 1, 1981,: зу, отделяют от жидкой фазы, содерр. 216-228, жащей 1.4,1.4, 1-глутамат: МАО Р -ок 2, Шатилов В.Р., Амбарцумян В.Г сидоредуктазу, центрифугированиемКретович В. А. Препаративное разде- и 1.4,1.5, -глутамат: МАО(Р)- ление глутаматдегидрогеназ из одно- . -оксидоредуктазу элюируют с осадклеточных водорослей.-Докл,АН СССР, ка 0,1 - 0,2 И фосфатным буфе 1972, 207, й 5, с. 1229-1232. ром.1 10Изобретение относится к физико-хичмической биологии и биотехнологии,в частности.к способам полученияи очистки ферментов.Известен способ получения иэо:.ферментов. путем аффинной хроматографии 1.1 3.Указанный способ является достаточно трудоемким и длительным,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому эффекту является способ разделения ферментов 1.4.1.31.-глутамат:МАО (Р)ф-оксидоредуктазы и 1.4,1.4,1.-глутамат:МАО Р+"оксидоредуктазы наодноклеточных зеленых водорослях,включающий получение .экстракта изклеток водорослей 1 21,Разделение,глутаматдегидрогеназпо известному способу предусматривает подготовку колонки с ДЗАЭ-целлюлозой, которая заключается в обработке ионообменника 0,5 И НС 1, а затем0,5 М МаОН с последующей отмывкой наворонке Бюхнера большим объемом дистиллированной воды до нейтральной реакции; заполнение колонки заряженнойДЭАЗ-целлюлозой и уравновешива- .ние ее стартовым буфером; предвари 446312тельную очистку бесклеточного экстракта от мешающих ионообменной хроматографии хлорофилл-липопротеидныхкомплексов, которая осуществляетсяосаждением белков сернокислым аммонием от 35 до 65 / от насыщения с последующим обессоливанием белковогопрепарата на колонке с СефадексомС;нанесение белкового препарата, 10 содержащего разделяемые ферменты,на готовую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой; промывку колонки стартовым буфером с целью удаления несвязывающегося с ДЗАЭ-целлюлозой белка;15 ступенчатую элюацию семью буфернымирастворами повышающейся ионнойсмолы, так как МАО (Р)-глутаматдегидрогеназа (1,4.1.3,1.-глутамат:МАО (Р)- оксидоредуктаэа) смывается с колонки 20 0,08-0,1 Мфосфатным буфером а МАО Р-глутаматдегидрогеназа (1.4.1.4-глутамат:МАО Р+-оксидоредуктаэа)-02 ММаС 1 в 0,1 М Фосфатном буфере. Т а б л и ц а 1Общая активность мкмоль/мин Удельная активност мкмоль/мин на 1 мгбелка Белок, мг Степень очистки Выход,офракции МАО (Р)- МАО РГДГГДГ МАО (Р)ГДГ.МАО РГДГ Бескле точный акстракт1710 363 36 0,212 0,02,1 100 Высаливание сернокислым аммонием,фракция35-654 от насыщения 623 160 18 0,028 0,257 1,25 50 14 3 24 0,413 12,6 0,0 0,0 фракция 0,1 ММаС в 0,1 Мфосфатном бу"фере 36,7 202 0,0 5,500 26 0,0 Хроматографияна ДЭАЭ-целлюлозе:фракция 0,08 Мфосфорный буФер 30,4 Вся процедура занимает 58-60 ч. Данные по разделению глутаматдегидрогеназ из СЬ 1 оге 11 а ругепо 1 доза 82 Т с помощью ионообменной хроматографии представлены в табл, 1.)мг Таблица 2 щщщщщщщщю Удельная активностьмкмоль/мин на 1 мг Степеньбелка очистки Общая, активность,. мкмоль/минфракция Выход,МАО (Р)щ МАО ГЛГ ГДГ МАО (Р) - МАО РГДГ ГДГ Бесклеточный экстракт0,13 3790 496 100 Надосадочная жидкостьпосле обработкираствором хлористого марганца и центрифугирования 2290 1,4 82 0,0 0,34 0,0 779 Элюат с осадкафосфата марганца 1010 470 0,0 0,47 3,6 95 0,0 3 1044631, . 4К недостаткам способа относится зеленой водоросли Ап 11 зйгодезецэ Ьгац-. то, что разделение МАО (Р) -глутаматщ . и1 (в случае другой водоросли темпедегидрогеназы и МАО Р-глутаматдегид-, Ратура экстракта мОжет быть повырогеназы является длительным, трудо- . 1 шена до 15 С), содержащего МАО (Р)щоемким, требует обязательной предва глутаматдегидрогенаэу и МАО Р-глущ рительной очистки и дает относитель- таматдегидрогенаэу, по каплям при но низкий выход ферментов, Кроме того, интенсивном перемешивании добавляют ДЭАЭ-целлюлоза является дефицитным Раствор МлС 12 (иэ расчета 2,5 мл импортным материалом. 1 М раствора пС 12 на 100 мл экстракЦель изобретения - ускорение спо О та). В этих условиях в течение соба и увеличение выхода ферментов,20.мин происходит образование иПоставленная цель достигается формирование осадка фосфата маргантем, что согласно способу получения ца, на котором адсорбируется МАО (Р); ферментов 1.4.1,3,1.-глутамат:МАО (Р)-. глутаматдегидрогеназа. Образовавоксидоредуктазы и 1.4,1.4,1."глута шийся осадок отделяется от надосамат :.МАО Рфоксидоредуктазы (дезами- дочной жидкости, содержащей МАО Р- нирующих) путем экстракции однокле-: , глутаматдегидрогеназу, центрифуги- точных зеленых водорослей фосфатным Рованием при 8000 д в течение 30 мин буфером с последующим фракционирова- и для Удаления захваченных осадком нием экстракта в экстракт добавляют 20 лишних белков, промывается 100 мл хлористый марганец до конечной кон- . 0,01 М фосфатного буфера РН 7,4.3 люцентрации 0,025-0,030 М, осадок Фос- Чия МАО (Р)щ глутаматдегидрогеназы фата марганца, сорбирующий 1,4,1,3,- с осадка осуществляется 0,1 М фосфат-. глутамат:МАО (Р)"щоксидоредуктазу,от- ным буФером рН 7,4 двумя порциями деляют от жидкой фазы, содержащей 25 по 100 мл.Обьединенный элюатсодерщ 1.4,1,4)1.-глутаматМАО Р+оксидоре- жит практически всю МАО (Р)щглутащ дуктазу, центрифугированием и 1.4.1,3, матдегидрогеназу, й,8 надосадочной 1.-глутамат: МАО (Р)+-оксидоредуктазу . жидкости сохраняется более 803 элюировать с осадка О, 1 щ 0, 2 М фосфатщ МАО Р.-глутаматдегидрогенаэы . Вся . ным буфером. З 0 процедура занимает 2,5 ч.П р и м е. р. К 400 мл охлажденно-Результаты разделения глутаматдего до 5 щ 7 С экстракта в 0,05 М фосфат гидрогеназ предлагаемым способом предном буфере (РН 7,4) из одноклеточной . ставлены в табл.2.1044631 Составитель С, КаспаровРедактор В.Петращ Техред В.Далекорей . Корректор С.Черни Заказ 7462/21 Тираж 523 . Подпи ное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб , д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,Таким образом, предлагаемый способ разделения глутаматдегидрогенаэ по сравнению с известным не требуе предварительной очистки ферментов,т позволяет разделить их уже на стадии бесклеточного экстракта; значительно сокращает время, необходимое для разделения (с 58 до 2,5 ч, т.е. более чем в 20 раэ); кроме того,уве личивается выход разделяемых фермен тов (по известному способу выход после разделения 56 и 24 для МАО (Р)- т глутаматдегидрогеназы и МАО Р- глута.е. матдегидрогеназы соответственно, а5 по предлагаемому способу 90 и 824);существенно снижается трудоемкостьи удещевляется весь процес разделения за счет исключения колоночной ионообменной хроматогра 10 фии,