Способ определения активности эндопероксидпростагландинсинтетазы в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧКЯРЕСПУ БЛИН 19) ОИ 61738 щ) 5 С 01 Я 33/88 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ТЕЛЬСТВ К АВТОРСКОМУ 48рственный уни Мевх А,Т, екулярные би с. 118-119,141. ЩСУДАРСТЗЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И О 1 НРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Варфоломеев С.ДПростагландины - мол орегуляторы. М.ф МГУ,Изобретение относится к биохимиии может быть использовано при определении активности фермента эндопероксидпростагландинсинтетазы,Цель изобретения - повышение чувствительности способа.Способ осуществляется следующимобразом.Биологический материал добавляютв реакционную смесь объемом 1 мл,содержащую 0,05 М трис-НС 1 буфер,рН 8,0,. арахидоновую кислоту и гемин, Активность фермента вычисляли, как начальную скорость по кривой поглощения кислорода и выражали в мо"лях арахидоновой кислоты на 1 мгбелка в минуту, считая, что припревращении 1 моль кислоты потреб 2(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭНДОПЕРОКСИДПРОСТАГЛАНДИНСИНТЕТАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение относится к биохимии и может бытьиспользовано для определения активности эндопероксидпростагландинсинтетазы. Цель изобрете" ния " повышение чувствительности способа. Способ заключается в обработке биологического материала при определении активности эндопероксидпроста- . гландинсинтетазы бенз(а)пиреном при массовом соотношении с ферментнык белком (2,5-25,2): 100. При этом активность фермента возрастает на величину до 71%, что дает возможность повысить чувствительность способа и сократить количество используемого биологического материала. 3 табл. ляется 2 моль кислорода и что начальная концентрация кислорода в реакционной смеси равна 2,4 х 10 фМ Интегральную кинетику поглощения кислорода исследовали также полярографическим методом с учетом неспецифического фонового поглощения кислорода. Концентрацию Темина определяли спектрофотометрически при 420 нм по поглощению восстановленного комнлек-са гемина с пиридином. Прединкубацию фермента с компонентами реак ционной смеси проводили непосредственно в полярографической ячейке.П р и и е р. В пробирку вносят 0,1 мл полициклического углеводороде бенз(а)пирена, растворенного в зтиловом спирте, конечная концентра. 310, 7 (71, 1+2, 8%)637,3 (145+4,6 Х)714,8 (163+3,5%) КонтрольБП (10М)БП (1 К+М)БП (10 М) ция в иссдадуемых пробах объемом 1 млсоставляла: 10"э, 10 и 10 , М или252252 2 52 мкг на 100 мкг Фермента эндопероксидпростагландинсинтетазы (микросомная Фракция из вези 5кулярных желез барана), Конечная концентрация этилового спирта в образцах не превышала 20%. Обработка Фермента эндопероксидпростагландинсинтетазы бенз(а)ниреном в соотношении252 мкг на 100 мкг белка вызываетингибирование его активности, а обработка фермента бенз(а)пиреном всоотношении 25,2; 5,4 и 2,52 мкгна 100 мкг - стимулирование активности фермента на 1,5-23%,Предварительная обработка чистого Фермента ьенз(а)пиреном в соотношении (2,5-25,2):100 вызывает повышение ее активности на 25 Х, Предварительная же обработка бенз(а)пиреном органов, и тканей животных всоотношении 2,5:100 - 25,2100 (или10 - 10 М) вызывает значительное 25увеличение содержания простагландинов Е и Р в микросомах клетокпечени крыс, которое составляет 4563% и 32-63% соответственно (табл,1).Это увеличение связано с активизацией фермента эндопероксидпростагландинсинтетазы после обработкибенз(а)пиреном,Было изучено также изменение содержания простагландинов после предварительной обработки .бенэ (а) пиуе 35ном в концентрации 2,52 мкг (10 М)различных тканей животных - сердца,печени, почки, селезенки и легких(табл, 2 и 3), Как видно из табл. 2 40и 3, самые значительные изменениянаблюдаются в печени, которые составляют .71 и 62,6 Х и соответствуют увеличению содержания простагландиновЕ и Рс, а в других тканях увеличение активности простагландинов Е и Р варьирует в пределах 34-57%. Такое изменение содержания простагландинов Е и Р после обработки ьенз(а)пиреном является также следствием активирования фермента эндопероксидпростагландинсинтетазы, Исключение составляют легкие, в которых изменение содержания простагландинов сравнительно ниже. Это следует отнести либо к ьыстрой инактивации фермента,.или к быстрому выведению простагландинов из ткани. Как видно из таблиц, после обработки бенз(а)пиреном наблюдается увеличение содержания простагландинов на 32-71% как в микросомах печени крыс, так и в различных тканях крыс.Таким образом, бенз(а)пирен вызывает существенно увеличение активности фермента эндопероксидпростагландинсинтетазы, которое, составляет 32-" 71 Х. Это позволяет повысить чувствительность определения фермента и существенно экономить биологический материал (" 40-50 Х). Формула изобретения Способ определения активности эндопероксидпростагландинсинтетазы в биологическом материале путем выделения из исследуемой пробы Фракции микросом, инкуьации фермента с арахидоновой кислотой в присутствии гемина и полярографической регистрации потреьления кислорода, о т л и ч а " ю щ и й с я тем, что, с целью новы- . шения чувствительности способа, био- логический материал предварительно оьрабатывают бенз(а)пиреном, взятым4 в массовом соотношении к ферменту 2,5-25,2:100,1617384 Таблица 2 Контрольныепробы Таблица 3 Контрольныепробы Составитель Н. ГуляеваТехред Л.Сердюкова Редактор И, Циткина Корректор И. Иакснмишинец Заказ 4117 Тираж 510 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат Патент , г.ужгород, ул, Гагарина,1 11И ф101 СердцеПеченьПочкаСелезенкаЛегкиеСердцеПеченьПочкаСелезенкаЛегкие Содержание простагландина Е, нмоль/мг белка,до обработки 520,4 741, 2 620,1 540,5 74,3 Содержание простагландина Р , пмоль/мг белка, до обработки 520,4 741, 2 б 20, 1 540, 5 74,3 Содержание простагландина Е, пмоль/мг белка,после обработки бенз(а)пиреном 700,0 (134,5+4,07) 1270,4 (171,4+5,6 Х) 873,6 (140,8+4,1 Ж) 795,7 (147,2+4,47) 82,2 (111,0+3,2 Ж)