Способ определения активности моноаминоксидаз в биологическом материале

(51) М. Кл. С 01 М 21/24 Государственный комитет Опубликовано 05,06,80, Бюллетень.21 па делам нзобретеннй н открытий(53) Уд К .543.42. .06 2 (088,8) Дата опубликования описания 09.0680(72) Автор изобретения А. И. Балаклеевский Минский государственный медицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, НН Изобретение отностттся к биологическим (биохимическим) методам исследования и предназначено для определения активности ферментов моноаминоксидаз (МАО) в биологическом материале с использованием в качестве субстратов индольных биогенных5 аминов.Известен способ определения активнос- ти моноаминоксидаз в биологическом материале путем обработки тирамина в сла 10 боосновной среде инкубации избытком семикарбазида в присутствии моноаминоксидазы с последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-динитрофенилгидразина экстракцией образовавшегося 2,4- )динитрофенилгидразона бензолом, обработкой щелочью бензольного экстракта и спектрофотометрированием полученного соединения 1 .20 Недостатком известного способа является его недостаточно высокая чувствител ьност ь,Цель изобретения - повышение точности способа.Указанная пель достигается тем, что серотонин или триптамин, используемые в качестве амина, обрабатывают в слабоосновной среде инкубации избытком семикарбазида в присутствии моноаминоксидазы с последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-дипитрофенилтидразина и измерением оптической плотности полученного раствора.Из серотонина (или триптамина) в среде инкубации, содержащей фосфатный буфер с рН 7,4 и избыток семикарбазида, в при-, сутствии МАО получают 5-оксиидолилацетальдегид (или индолилапетальдегид) 10 /1 . 1 Сй-СН-МИ Н 0 Нс ф - ,сн,-с +нн о+н а Щ3 739381 который, взаимодействуя с семикарба- И зидом, дает семикарбазон (что предохрв- а няет альдегид от дальнейшего окисления) б 10 СН-С=К-С-МН 1 1 й йН НО Й НОН йт 1 О ф2 125КО2 МНОГидрофобный гидразон 5-оксииндолилацетальдегида уже через несколько минут об разует мелкодисперсную суспензию, концентрация которой, а вместе с этим светопоглощение и светорассеяние, постепенно возрастает, достигая максимального устойчивого значения в течение 20-30 мин. 40 Интенсивность светопоглощения (или светорассеяния) мутного раствора определяют турбидиметрически (или нефелометрически), используя любой доступный копориметр (нефелометр), микрокалориметр, фЭК или 45 спектрофотометр. Разница между экстинкцией опытной и контрольной (инкубация проводится в отсутствие субстрата биогенного аййва илнв отсутствие источника фермента) проб слу-,50 жит мерой активности фермента в условных единицах после пересчета на 1 г свежей ткани или 1 мг белка за 1 ч инкубации.Для пересчета активности МАО иэ ус 55 ловных в абсолютные единицы более доотупным является построение калибровочного графика с определением образующегося в НО,ИСН -СЪ - - аО Н СНИН я 1 и 2Н О После удаления блоков с помощью трихлоруксусной кислоты в пробу вноситсяизбыток 2,4-динитрофенилгидразина, который взаимодействует с семнкарбазином, образуя гидрофобный гидразон фнкубационной среде под действием МАОммиака, так как получение весьма нестаильных альдегидов биогенных аминов ипоследующая работа с ними весьма затруднительнаа.Инкубационная смесь состоит из компонентов, мп: раствор фосфатного буферас рН 7,4; 1,0 0,1 М; нейтрализованныйраствор семикарбазида солянокислого0,2 0,5% ного нейтрализованный растворсеротонин-креатининсупьфата 0,25 1%-ного(6,25 мкмоль); (или раствор триптаминвсолянокислого; 0,25 0,2%-ного2,5 мкмоль;); источник фермента (10%ные гомогенаты тканей, субкпеточнйефракции и др, 0,2-0,5).После 1 ч инкубации при 37 С в пробы добавляют по 1,0 мп 107 ного раствора трихлоруксусной кислоты, после чегоих центрифугируют, В контрольные пробыпосле трихлоруксусной кислоты добавляютсубстрат, К прозрачному безбелковому ".центрифугату добавляют по 0,2 мл 0,1%ного раствора 2,4-динитрофенипгидразина,приготовленного на 2 н. растворе соляной кислоты, и, образовавшаяся суспензия гидразона индолилацетальдегида, через 20-30 минтурбодиметрируется (на спектрофотометреипи фотоэпектроколориметре с зеленым 0 фильтром) или нефепомэтрируетСя. Приизмерении на фЭК-М экстинкция опытныхпроб, содержащих в качестве источникаМАО 10-25 мг. свежей ткани мозга или1-3 мг белка, превышает экстинкцийконтрольных проб, инкубируемых без субстрата, в 20-30 раз, что позволяет надежно работать уже с малыми активностями фермента и неочищенными препаратами (источниками) МАО. Прирост продукта ферментвтивной реакции и величиныэкстинкции в пробах прямо пропорциональны продолжительности инкубации (от15 мин до 2 ч) и количеству источникафермента МАО в инкубационной среде(1-100 мг ткани). Митохондриальнаяфракция из ткани мозга и печени обладает максимальной удельной активностьюМАО. Метод высокоспецифичен дпя определения МАО, так как при введении в организм ипи добавлении в инкубационнуюсреду больших доз ингибиторов МАО активность фермента полностью угнетается.Точность. метода + 3% (из 5 параллельных определений). Чувствительность метода достаточно высокая дпя того, чтобыизмерить активность МАО с. небольшимиколичествами различных тканей. 1 мкмоньпродукта реакции, образующегося из серотонина, дает 0,5 единиц и из триптами5 7393на 0,55 единиц прироста экстинкции в условиях предлагаемого метода (фЭК М,проба объемом 2,5, мл. цовета с толщиной слоя раствора 0,5 см),Молярный коэффициент экстинкции (Ю )гидраэона в суспензии равен 2000 М смдля серотонина и 2200 М см длятриптамина, Выход конечного продуктав форме гидраэона альдегида, образующего суспенэию, составляет 55% 1 адля серотонина и 60% для триптами 81 6на от всего копичества эквивалентов образующегося в инкубационной среде в ходе ферментативной реакции альдегида (или аммиака).В табл. 1 представлена активность МАО с субстратом серотонином в мозге крыс после введения различных доз транс амина.В табл. 2 представлена активность МАО с субстратом триптамином в мозге крыс после введения трансамина.,"К о о о со о о со 6 СО соооо со о о со О о оасо со со о о о о о о о о о о о о о о о д о со со а Я ф1- т- т- л а сч" о о о оооооооо73938 11формула изоЬретенияСпособ определения активности моноаминоксидаз в биойогическом материале путем обработки амина в слабоосновной среде инкубации избытком семикарбазида в присутствии моноаминоксидазы с после дующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-динитрофеницгидразина и измерением оптической плотности полученного раствора, о т л и ч а ю щ и й с я тем,12что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве амина испопьзуют серотонин или триптамин. Источники информации,прийятые во внимание при экспертизе 1.Ь.ЕЕО АЛсед НаодМоп Т.М.Асо Согпюгю ееЮоб 1 огеМвОоо о тоооавюе оибсее, В 1 осИепцсаС Хоо ОЫ,1961,Д Ь,Ф 1,р 1 12-4 Ч 5 (прототип) .Составитель С, ХованскаяРедактор М, Недолуженко Техред М, Петко Корректор М. ВигулаЗаказ 3025/6 Тираж 1019,Подписное ЦНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 фипиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная. 4