Способ определения над-зависимой формиатдегидрогеназы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 504 С 12 Ц/66 ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕ ЕЛЬС оЙерепйеп ше 1 йу 1 оРпг 1 ГсаЕиг.569-576,-ЗАВИСИМ),заоличек биохи- формнатастворах, микробиотабл. сширениетей способа,оцесса. обр логии и б собу опре миатдегид клеточных включает наточной оболо т нанти при- фармацевтичесмикроорга менение в кой и мик е сахароэы глицерина медицинской, обиологическо ромыпшен- сследовава кже в научнь сти,яхконцентрации вием катионГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИ(56) Ач 1 оча Т.Ч, е 1 а 11. В 1 ояуп 1 Ьяя ригИсат,оп апй ргорег.Ь я оГГогша 1 е с 1 е 1 уйгояепаяе Тгош уеаяСяСапМйа шет,пу 11 са. - Епг.,1. ВосЬ1985, ч,5, р. 657-662,Едогоч А.М. а 1 а 11, ИаГРогшат,е беЬуйгодепаяе Ггош1 горМ.с Ьас 1 егщп 51 гаЫ 1.ф акоп апс 1 сЬагасег к а 1 акоп.Восйеш, 1979, ч,99, р,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАМОИ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ(57) Изобретение относитсямии, в частности к анализудегидрогеназы в клетках ии может найти применение в ние относится к микроби химии, в частности к споления НАД-зависимой форгеназы в растворах, бескстрактах и целых клетках 80151837 логическои промьппленности, медицине а также в научных исследованиях.Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа, упрощение и ускорение процесса. Сп соб определения НАД-зависимой формиатдегидрогенаэы предусматривает частичное разрушение оболочки клето микроорганизмов замораживанием-раям раживанием или обработкой лизоцимом или кзтионным поверхностно-активным веществом в растворе глицерина или сахароэы с последующей детекцией НЛДН биолюминесцетным методом в при сутствии иммобилизованных НАДН.ФМН оксидоредуктаэы и люциферазы ВепесК Ьагчеу. Способ позволяет определят нативный фермент в целых клетках ба терий и дрожжей, имеет достаточно0 высокую чувствительность (1 Окроме того, формиатдегидрогенв может быть обнаружена в микрок ствах исходной биомассы, что особен но важно при анализе генных клоноте Цель изобретения - рфункциональных возможноупрощение и ускорение иПредлагаемый способруюение целостности клеки в 1 О-ном растворили 20-307-ном растворезамораживанием-раэморажиобработкой лиэоцимом в1-2 мг/мп, или воздейстного поверхностно-активного веществав концентрации 0,001 -0,01 мг/мл суспензии, Детекцию НАДН, образующегосяпри ферментативной реакции, проводятбиолюминесцентным методом в присутствии иммобилизованных НАДН.ФМНоксидоредуктазы и люциферазы.Предлагаемый способ позволяетопределять формиатдегидрогенаэу вцелых клетках микроорганизмов, чторасширяет технологические возможности способа и значительно упрощаетпроцесс по сравнению со сгектрофотометрическим методом, связ.иным с необходимостью получения бесклеточного экстракта центрифугированиемклеточной суспенэии,Обработка бактерий и дрожжей врастворе сахароэы или гл:щерина перечисленными способами в отличиеот действия ультразвуком не приводитк полному разрушению клеточной стенки и выходу формиатдегидрогеназы враствор, а лишь частично разрушает 25ее, образуя каналы, через которыеосуществляется свободная диффузиясубстрата и кофактора, Формиатдегидрогеназа остается внутри клеткив этих условиях в течение длитель- З 0ного времени сохраняет свою активность, что позволяет определятьчрезвычайно малые концентрации фермента паже в случае высоколабильногофермента.35Применение сахарозы или глицерина способствует также равномерномураспределению клеток в объеме, чтогарантирует надежность и воспроизводимость результатов. Снижение концентрации сахарозы (ниже 10 мас.7)или глицерина ниже 20 об.%) приводит к частичному осаждению клеток,а увеличение концентрацин,.сахарозыи глицерина выше укаэанных пределов 45снижает скорость ферментативнойреакции эа счет увеличения вязкостираствора, причем и в том, и в другомслучаях уменьшается чувствительностьметода.50При разрушении клеточной стенкипод действием лиэоцима используютконцентрации 1-2 мг/мл клеточнойсуспенэии. уменьшение концентрациилиэоцима ниже 1 мг/мл суспензииуменьшает чувствительность метода, ис.пользование концентрации выше 2 мг/млсуспенэии нецелесообразно, так какне влияет на чувствительность метода,Для нарушения целостности клеточной оболочки можно использовать поверхностно-активные вещества катионной природы, тогда как применение анионных или неионных поверхностно- активных веществ не является эффективным. В качестве катионного поверхностно-активного вещества могутиспользоваться петиптриметиламмонийбромид, цетилпиридиний хлорид, цетилэтилдиметиламмоний бромид и т,д. вконцентрации 0,001-0,01 мг/мл суспенэии клеток. При использовании концентрации ниже 0,00 мг/мл уменьшается чувствительность анализа, приувеличении концентрации выше0,01 мг/мл происходит инакгпвацияиммобилиэованньгх НАДИ:ФМН - оксидоредуктаэы и люциферазы, что такжеприводит к уменьшению чувстпптел ности анализа,Биолюминесцентный метод с использованием НАДН:ФМН - оксидоредуктаэыи люциферазы позволяет определятьформиатдегидрогеназу в клеткахрастворах в концентрации до 1 О М,Для этого к клеточной суспен нч плираствору, содержащему формиатдегнлрогеназу, добавляют НЛЛН,:ФМ 1 -. оксидоредуктазу и люцнферазу Г п.сХсаагаву, совместно иммобилп".ов,п ныена ВгСЕ-агароэе, и субстрты этихферментов-флавинмононуклеотидьМН)и деканаль, Иммобилизации НА,.111 ФМНоксидоредуктазы и люциферазы Н ,.-.оКенйа еу приводит к значительной стабилизации пх ферментогивной, кивнзс -ти в условиях данной реакции. 1 ммобилизацию НАДН 1.ФМН - оксипореуктазыи люциферазы БепесКеа пь ",.у осуществляют инкубацией экстракта клетокс агароэой, активированной 11 гС 11,П р и м е р 1, Определение активности формиатдегидрогеназы в целыхклетках Ряеийошопая .яр. 101,В качестве продуцента исполья;ютштамм метилотрофных бактерий я.-.ийошопая яр 01 М ВКМ ВД Институтамикробиологии АН СССР. Клетки 10 /млсуспендируют в 0,5 М калийфосфатномбуфере, рН 7,0, содержащем 157 сахарозы, и подвергают последовательномуозамораживанию при -20 С и раэмораживают при 25 С, 2 мл полученной суспензии помещают в кювету люмипометра,добавляют 00 мкл 0,25 нМ раствораФМН в воде, 100 мкл 0,5 н 1 растворадеканаля в 2%-ном растворе изопропа 5 15183кола и ОО мкл суспензии иммобилиэованных НАДН,ФМН - оксидоредуктазы илюцифераэы Вепес 1 еа Ьагчеу 1. Добавляют 100 мкл 25 нМ раствора НАД в наде.и регистрируют фоновое свечение. Затем добавляют 100 мкл 3 М раствораформиата натрия и регистрируют свечение. Интенсивность свечения, определенная по разности между интенсив Оностью сигнала в присутствии формиата натрия и н отсутствии последнего,составляет 20 мВ н 1 мин, что соответствует 4 1 О ф М формиатдегидрогеназы. 15П р и м е р 2. В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспенэиипо примеру 1, но в 107-ном растворесахароэы, Добавляют 100 мкл 0,25 нМраствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1, Интенсивностьсвечения составляет 8 мВ в 1 мин,что соответствует 3,6 10 фМ формиатдегидрогеназы,П р и м е р 3. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспенэиипо примеру 1, но н 107.-ном растворесаха 1 озы, Добанляют 100 мкл 0,25 нМраствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность 30свечения составляет 22 мВ в 1 мин,что соответствует 4,4.10 М формиатдегидрогенаэы.П р и м е р 4. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной сус 35пензии по примеру 1, но в 57.-номрастворе сахароэы, Добавляют 100 мкл0,25 нМ растнора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1Интенсивность свечения составляет 1 мВ в 401 мин, что соответствует 2,2 10 ф формиатдегидрогеназы,П р и м е р 5. В кювету люминометра помещают 2 мп клеточнойсуспензии по примеру 1, но в 303-ном растворе сахарозы. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1Интенсивность свечения 12 мВ н 1 мин, соответствующая 2,4 10 М формиатдегидрогенаэы.П р и м е р 6, В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспензии по примеру 1, но в 207"ном растворе глицерина., Лобавляют 100 мкл0,25 нМ раствора ФИН н воде и остальные реагенты по примеру . Интенсинность свечения составляет 22 мВ н 7661 мин, что соответствует 4,4 1 О "1формиатдегидрогеназы,П р и м е р 7, В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензиипо примеру 1, но и 257,-ном раствореглицерина. Добавляют 100 мкл 0,25 нМраствора ФМН в воде и остальные реагентыпо примеру 1, Интенсивность свечениясоставляет 21 мВ н 1 мин, что соответствует 4,2 1 О " М формиатдегидрогеназы,П р и м е р 8. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии;по примеру 1, но в 303-номрастворе глицерина. Добавляют 100 мкл0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальье реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 20 мВ вмин, что соответствует 4,0 1 О " Мформиатдегидрогенаэы,П р и м е р 9. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензиипо примеру 1, но в 10 7.-но растворе глицерина. Добавляют 100 мкл0,25 нМ раствора ФМН н воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 15 мВ в- 1 о1 мин, что соответствует 3 1 Т Мфермента.П р и м е р 10, В кюнету люминометра помещают 2 мл клеточной суспенэии по примеру 1, но в 407-ном глицерине, Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН н воде и остальные реагенты ло примеру 1. Интенсивность свечения составляет 14 мВ н 1 мин, что,соответствует 2,8 10 "М формиатдегдрогенаэы. П р и м е р 11, В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспензии Рееийошопае ер, 101, содержащей 10 клеток на 1 мл и 15 Е-ной сахаро 5зы, и добавляют 2 мг на 1 мл лиэоцима. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФИН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения.е составляет 18 мВ н 1 мин или 3,6 10 М фермента.П р и м е р 12В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 11, а лизоцима добавляют 1 мг на 1 мл. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФИН н воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения составляет 16 мВ в 1 мин, что соответствует 3,0 Т" М фермента.50 П р и м е р 13. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 11, а лизоцим добавляют в количестве 3 мг на 1 мл. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМНв воде и остальные реагенты по примеру ). Интенсивность свечения составляет 18 мй в 1 мин, что соответствует 3,6 10-"М формиатдегидрогенаэы. ОП р и м е р 4. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспенэии Ряецйошопая яр. 101, содержащей 10 клеток в 1 мл 0,5 М калийфосфатного буфера, содержащего 153 15сахароэы, и добавляют 100 мкл0,0) ,-ного раствора катионного поверхностно-активного вещества цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде 20и остальные реагенты по примеру 1.Интенсивность свечения составляет24 мВ в 1 мин, что соответствует4,8 ОМ формиатдегидрогеназы.П р и м е р 15. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии по примеру 14 и добавляют100 мкл 0,005%-ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в 30воде и остальные реагенты по примеру1. Интенсивность свечения равна22,8 мВ в 1 мин или 4,6 10 ф М формиатдегидрогеназы.П р и м е р 16. В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензия по примеру 14 и добавляют100 мкл 0,000) -ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в 40воде и остальные реагенты по примеру 1, Интенсивность свечения равна22 мВ в ) мин или 4,4 .10 " М формиатдегидрогеназы,П р и м е р )7В кювету люминометра помещают 2 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток в1 мл 0,5 М калийфосфатного буфера,содержащего 15 сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,0005 -ного растворацетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствораФМН в воде и остальные реагенты попримеру 1. Интенсивность свеченияравна 18 мВ вмин или 3,6 10 Мформиатдегидрогенаэы,П р и м е р 18, В кювету люминометра помещают 2 мп клеточной суспензии Ряецйсшспая яг. 101, содержа. щей 10 ф клеток в 1 мл О, М калийфосфатного буфера, содержащего 15 сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,023-ного раствора цетилэтнлдиметиламмоний бромида, Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения 15 мВ в 1 мин, что соответствует 2,8 10 "М формиатдегидрогеназы.П р и м е р 19, Определение фор миатдегидрогенаэы в целых клетках метилотрофных дрожжей Свп 6 Ыа шеСЬу 1 са ИБФМ У.В кювету люминометра помешают 2 мл клеточной суспензии СапбЫа шеСЬу 1 са в 0,1 М калийфосфатном буфере, содержащей 10 клеток и 15% сахарозы, и добавляют 100 мкл 0,0) -ного раствора цетилтриметиламмоний бромида. Добавляют 100 мкл 0,25 М раствора ФМН и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения 24 мВ в 1 мин или 4,8 .О " Мформиатдегидрогеназы,П р и м е р 20. Определение НАДзависимой формиатдегидрогенаэы вцелых клетках ЕясИегсМа со 1)В кювету люминометра помещают.2 мл клеточной суспензии Е, со 1,содержащей 1 О " клеток в 1 мл 0,1 Мкалийфосфатного буфера и 157 сахарозы, и добавляют 2 мг лизоцима. Добавляют )00 мкл 0,25 нМ раствораФМН в воде и остальные реагентыпо примеру 1. Интенсивность свеченияравна О, т.е. НАД-зависимая формиатдегидрогеназа в клетках Е. со 1отсутствует.П р и м е р 21. Определение НАДзависимой формиатдегидрсп енаэы в целых клетках 2 асСоЬас 11 ця саяе,В кювету люминометра помещают 2 млклеточной суспензии, содержащей1 О клеток в 1 мл 0,1 М калийфосфатного буфера и )5 сахароэы, и добавляют 2 мг лизоцима. Добавляют 100 мкл0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1, Интенсивность свечения равна О. НАД-зависимая формиатдегидрогенаэа в клетках2 асСоЬасП 1 ця саяе 1 отсутствует.П р и м е р 22. Определение НАДзависимой формиатдегидрогеназы врастворе (бесклеточном экстракте).В кювету люминометра помещают2 мл раствора 0,1 М калийфосфатногобуфера, содержащего формиатдегидро1518376 генаэу. Добавляют 100 мкл 0,25 нМ раствора ФМН в воде и остальные реагенты по примеру 1. Интенсивность свечения (мВ в минуту) определяют для различных концентраций фермента.В таблице дана интенсивность свечения в зависимости от концентрации формиатдегидрогеназы в растворе. Номер Концентрация Интенсивность фермента, М свечения,мВ/минФормула изобретения 1 2, 3 4 5 0,8 1 О"1,6 1 О2,4 1 О "3,2 10 "4810" 4,2 7,2 9,6 14,9 19,8 Составитель А,КарякинТехред М.Ходанич Корректор В.Гирняк Редактор М.Петрова Заказ 6568/31 Тираж 501 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул, Гагарина, 101 Предлагаемый способ позволяет определять нативный фермент в целых клетках бактерий и дрожжей, имеет достаточно высокую чувствительность определения НАЦ-зависимой формиатдегидрогенаэы (10М) и, что особенно важно для анализа генных клонотек, представленных несколькими тысячами генно-инженерных штаммов, фермент может быть обнаружен в микроколичествах исходной биомассы (для проведения одного анализа достаточно 1 О клеток). Последнее особенно важно в том плане, что осуществление процесса наращивания биомассы для определения активности НАД-зависимой формиатдегидрогенаэы по методу, указанному в прототипе, может носитьпринципиальные сложности в связи спроблемой экспрессии геновПреимуществами предлагаемого метода являются также быстрота определения(2-3 мин) и возможность автоматизации процесса измерения, что также 10 имеет принципиальное значение присерийных анализах. 15 Способ определения НАД-зависимойформиатдегидрогеназы микроорганизмов, включающий нарушение целостности клеточной оболочки, последующую детекцию НАДН, образующегося в реэуль тате ферментативной реакции, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения функциональных воэможностей сйособа,упрощения и ускорения процесса, нарушение клеточной обо лочки проводят в растворе сахароэы сконцентрацией 10-202 или в растворе глицерина с концентрацией 20-303 замораживанием-раэмораживанием, или обработкой лизоцимом в концентрации 30 1-2 мг/мп, или воздействием катионного поверхностно-активного вещества в концентрации 0,001-0,01 мг/мп, а детекцию НАДН проводят биолюминесцентным методом в присутствии иммобилизованных НАДН:ФМН - оксидоредуктазы и люцифераэы.