Способ получения рибои дезоксирибонуклеозид-5 трифосфатов

: пффф/Р ОПИ САНИ А ВТОРСКОМЮ ОБ Я ДЕТЕЛЬ юл.2 едовате огическ ьский конс й институт ивных в Т,Л.Гу Ф.Подго 8)ьеваный ССеявап М.ЕВдордуя.87.во СССР10, 19/20 Е.Б.С осдев. 9, р.82детельс07 Н 19 утаровым альдегидом лозе или аминпропил ексного ферментного леотидилкинаэ и аце рованных г ноэ тилцеллю иохими л исполь леннос р ме к кси парата, н назы, взя ным нукле 20) и по ибо- иосфатовупроще для производства р онуклеоэид-триф Цель изобретения а и повышение вых и а целев пр с исходной биомассКЕили Е.со 1 дфагом Т 4 ав 9 82)азвуком;полученной клеточийфосфатным буфер7,7-7,8, содержаг Е.со ин- иэоа заклю нуклеоэ тся в5 -тривующих исутосфата,ра д (ЕСущность с следующем. Си фосфатов пров нуклеоэид- ствии ионов М калийфосфатно попощью иммоб со 1 д М ванной теэд из соответст осфатов в пр АТФ, ацетилф фера рН 7,5- ванного на а фицир цимомоб ультботка нойнымим декзии калром рН сусле раств ивилиэ ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относится к биохимиии биотехнологии и может быть использовано в биохимической промышленности для производства рибо- и деэоксирибонуклеозид-трифосфатов. Цель -Изобретение относится ки биотехнологии и может бытзовано в биохимической пром 8014936 изобретения - упрощение способа и 1 довышение выхода целевых продуктов. Исходную биомассу Е.со 1 д разрушают, полученную клеточную суспенэию обрабатывают калийфосфатным буферным раствором рН 7,5, содержащим декстран, полизтиленгликоль (ПЭГ) в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.7 соответственно. Смесь центрифугируют, супернатант, содержащий 11 ЭГ иммобилизуют на аминопропилсилохроме или аминоэтнлцеллюлоэе и исдольэуют для фосфорилированин соответствующих нуклеозид -монофосфатов с добавлением в реак(ционную смесь ионов Меацетилфосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза С дАТФ и калийфосфатного буфера рН 7,5,Я Выход всех рибо- и дезоксирибонуклеоэид-трифосфатов составляет 95-987.Способ прост в технологическом отно- С шении и может беэ дальМейшей доработки использоваться в промышленности. 2 э.п.ф - лы, 3 табл.4 ь Ж го в соотношении с исхид-монофосфатами 1:ченного по следующей с3 149364 стран, полиэтиленгликоль (ПЭГ),в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.7, соответственно.Полученный после центрифу ирова 5 ния смеси супернатант, содержащий ПЭГ, используют в качестве комплексного ферментного препарата, содержащего ацетокинаэу и оптимальный набор нуклеотидилкиназ, позволяющий полу чать рибо- и деэоксирибонуклеозид- трифосфаты с высоким выходом, аименно выход в синтезе всех НФТ составля- ет 95-987. или 350-400 г/кг биомассы.П р и м е р 1. Операции по очи стке комплексного ферментного препарата нуклеотидилкинаэ проводят при 0-4 С.100 г замороженных клеток Е.со 1 ИВЕсуспендируют в 300 мл 0,1 М 20 калийфосфатного буфера рН 7,8. В суспензию добавляют 200 мг лизоцима, предварительно растворенного в 40 мл буфера, выдерживают в течение 45 мин при постоянном перемешивании. После этого суспензию озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом дезинтеграторе (18 кГц) в три сеанса по 1 мин с минутными перерывами. Затем в полученную клеточную суспензию добавляют 30 0,1 Г 1 калийфосфатный буфер рН 7,8, содержащий 207.-иый раствор декстрана (м.в. 500000) и 402-ный раствор ПЭГ (м.в. 6000), до конечных концентраций 1,2 и 7,07 соответственно. Смесь пе ремешивают в течение 20 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Верхнюю фазу, содержащую ПЭГ, сливают и используют как комплексный ферментный препарат. Ферментный препарат им мобилгзуют на аминопропилсилохроме, активи диванном глутаровым альдегидом.Для активации 100 г (вл,мас.) АПС используют реакционную смесь следующего ссстава: 90 мл 257.-ного глутаро вого альдегида, 540 мл 1 М калийфосфатного буфера рН 7,8. Реакцию активации проводят в течение 3 ч при ком. натной температуре при перемешивании реакционной смеси вращением колбы.50 По окончании реакции сорбент отмывают от глутарового альдегида водой. Иммобилиэацию проводят при нагрузке по белку на матрицу 50 мг/г вл,мас. и концентрации белка в реакционной смеси 5 мг/мл в 0,1 М калийфосфатном буфере рН 7,8 при комнатной температуре в течение 3 ч при перемешивании реакционной смеси вращением колбы. 4 4Затем иммобилизованный ферментный препарат обрабатывают при перемешивании двойным объемом 0,27.-ного раствора боргидрида натрия в течение 1 ч при 2-4 С. После этого ИФП промывают 0,5 М раствором хлористого калия в 0,5 М калийфосфатном буфере рН 7,5, затем 0,05 М калийфосфатным буфером рН 7,5. Количество иммобилизованного белка в 1 г готового ИФП 25 мг.Реакционную смесь, содержащую в 1 л 0,05 М калийфосфатного буфера (рН 7,5)5 г гуанозин-монофосфата (ГМФ), 18,4 г ацетилфосфата, 16,24 г МС 1 , 1,10 г АТФ, 150 мкм р-меркаптоэтанола, 100 г ИФП, инкубируют при 37 ОС при перемешивании вращением колбы. Полноту синтеза ГТФ определяют ионообменной хроматографией на микро- колонке с анионообменником Дауэкс 1 х 2. Выход .ГТФ в синтезе составляет 987Целевой продукт ГТФ из реакционной смеси вьщеляют известным способом. Для этого реакционную смесь с целью разделения ее компонентов хроматографируют на колонке объемом 1 л, заполненной анионообменником АВ 17 х 2. Элюцию проводят линейным градиентом хлористого натрия (0-0,5 М) в 3 мМ НС 1. Элюат ГТФ собирают фракциями по 0,5 л, нейтрализуют до рН 7,0, затем концентрируют упариванием при 37 С до концентрации соли в нем 1;5 М. Продукт выделяют осаждением из сконцентрированного элюата предварительно охлажденной до -15-20 С смесью2 М НС 1 967.-ный этиловый спирт при соотношении концентрат ГТФМ НС 1 - этиловый спирт = 1:1/10:1 О, приливая вначале при перемешивании раствор кислоты, затем этиловый спирт. Для формирования осадка ГТФ смесь выдерживают при -15-20 ьС в течение 1 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс.об/ /мин в течение 15 мин при 2-4 С, Затем аналогичным образом проводят очистку ГТФ переосаждением, при этом осадок ГТФ предварительно растворяют в воде. Полученный осадок ГТФ прою- вают этанолом и лиофильно сушат. Выход готового продукта составляет 4,6 г.Препарат идентифицируют методом тонкослойной хроматографии, используя пластины силуфола или кизельгеля 60 Р 254 в системе диоксан-иэопропи 149364450 П р и м е р 10. Ферментный препарат выделяют иэ 200 г клеток Е.со 1 МНЕаналогично примеру 1. Ферментный препарат иммобилиэуют на ами 5 нопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 180 г ИФП. Выход УТФ составляет 967, 1 ОП р и м е р 11. Ферментный препарат выделяют иэ 50 г клеток Е,со 1 В, инфицированных фагом Т 4 аш В 82, и иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом, 15 аналогично примеру 1.В реакционную смесь, содержащую 5 г аденозинмонофосфата, загружают 50 г ИФП. Выход АТФ в синтезе составляет 983, выход готового продукта 20 6,0 г.Выходы АТФ в синтезе и выходы готовых препаратов АТФ при дальнейшем использовании указанного ИФП приведены в табл.2. 25П р и м е р 12. Ферментиый препарат выделяют из 50 г клеток Е.со 1 ь В, инфицированных агом Т 4 ащ М( 82, аналогично примеру 1, за исключением того, что испольэу:эт 0,1 М натрийборатный буфер рН 7,8. Ферментный препарат иммобилиэуют на АПС аналогично примеру 1, за исключением того, что на стадии иммобилизации используют 0,1 М натрийборатный буфер рН 7,8.В реакционную смесь, содержащую 5 г дезокситимидинмонофосфата, загружают 60 г ИФП. Выход дТТФ в синтезе составл:.тот 972, выхсд готового пре парата;ТТФ 5,3 г.П р и м е р 13. Ферментный препарат вщеляют иэ 50 г клеток Е.со 1 д МКЕаналогично примеру 1. Ферментньп( препарат иммобилиэуют на аль 4 дегидоси.чохроме, полученном модификацией силохрома с помощью (3,3-диэтоксипропил)триэтоксисилана, в лабораторных условиях НИКТИ БАВ.Иммобилиэацию проводят при на" груэке по белку на матрицу 50 мг/г вл.мас. и концентрации белка в реакционной смеси 5 мг/мл в 0,1 М калийфосфатном буфере рН 7,8 при комнатной температуре в течение 3 ч при перемешивании реакционной смеси враще 55 нием колбы. Дальнейшую обработку иммобилизованного фермента препарата проводят аналогично примеру 1. Количество иммобилизованного белка в 1 г готового ИФП 30 мг.В реакционную смесь, содержащую 5 г деэоксицитидинмонофодфата, загружают 55 г ИФП. Выход дЦТФ в синтезе составляет 987, выход готового препарата 3,0 г.П р и м е р 14. Ферментный препарат выделяют иэ 50 г клеток Е.со 11 МВЕ, инфицированных фагом Т 4 аш 9 82, аналогично примеру 1. Затем ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом.В реакционную смесь, содержащую 5 г деэоксигуанозинмонофосфата, загружают 50 г ИФП. Выход д."Тф в синтезе составляет 967., выход целевого продукта 4,6 гУсловия получения НТФ и выход продуктов приведены в абл.3.формула изооретенияЬ1. Способ получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-трифосфатов(включающий разрушение клеток биомассы Еэ"пегсЬа со 1 В или Е.со 11 МВЕ, инфицированньх фагом Т 4 аш 9 82, выделение из полученной клеточной суспенэии комплексного фермент- ного препарата, содержащего нуклеотидилкьазу и ацетокиназу, иммобилизацию последнего на активированной матрице и последующее фосфорилирование соответствующих рибо- и дезоксирибонуклеоэид-монофосфатов с помощью полученного иммобилизованного ферментного препарата с добавлением вх+ реакционную смесь ионов Мя , ацетилфосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза дАТФ и фосфатного буфера, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевых продуктов, комплексный ферментный препарат выделяют путем оЦработки клеточной суспензии буферным раствором, содержащим декстран, полизтиленгликоль в концентрациях 1,0-1,5 и 5-О мас.Е соответственно, а фосфорилирование соответствующих нуклеоэид-монофосфатов иммобилиlзованным комплексным ферментным препаратом проводят при соотношении 1: (10-20) соответственно.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в качестве буферного раствора используют калийфосфат 5 14936ловый спирт - 5 М аммиак - 1 М ацетатаммония - 30:18;49:3, Содержание Уфпоглощающих примесей в препарате 27,содержание основного вещества 997П р и м е р 2, Ферментный препарат вьщеляют иэ 50 г клеток Е.со 11 В,инфицированных фагом Т 4 ав У 82, аналогично примеру 1, эа исключением то"го, что используют декстран и ПЭГ вконцентрациях и 5 Х соответственно.Ферментный препарат иммобилиэуют нааминоэтилцеллюлозе, активированнойглутаровым альдегидом, аналогичнопримеру 1, за исключением того, что 15иммобилизацию проводят при 2-4 С втечение 14 ч.Хроматографию и выделение дТТФпроводят аналогично примеру 1, за исключением того, что для люации ком- Щпонентов реакционной смеси используют хлористый литий, а осаждение продукта проводят смесью метанол-ацетонпри соотношении концентрат дТТФ - метанол - ацетон = 1:1:10, приливая 25вначале при перемешивании метанол,затем ацетон,Препарат идентифицируют тонкослойной хроматографией, используя пластины силу;.ола или кизельгеля 60 Е 254 30в системе диоксан - изопропиловыйспирт - 2 М аммиак - 1 М ацетат аммония = 30:20;47:3, Содержание Уф-поглощающих примесей в препарате 27, содержание основного вещества 977.Условия препаративного выделенияпродуктов НТФ, их иденти.1 икация, степень чистоты гредставлены в табл.1. П р и м е р 3. Ферментный препа рат выделяют из 50 г клеток Е.со 11 В, инфицированных фагом Т 4 ащ У 82, аналогично примеру 1, за исключением того что используют декстран, ПЭГ в концентрациях 1 и 57 соответственно, 45 ферментный препарат иммобилизуют на аминоэтнлцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом.В реакционную смесь, содержащую 5 г дезокситимидинмонофосфата, загру тают 60 г ИФП. Выход дТТФ составляет 963.П р и м е р 4. Ферментный препарат вьщеляют иэ 50 г клеток Е.со 11 МНЕан ог Яно примеру 1 эа ис ключением того, что используют декстрак и ПЭГ в концентрациях 1,5 и 10 Х соответственно, Ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме,44активированном глутаровым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г деэоксицитйдинмонофосфата, загружают 65 г ИФП. Выход дЦТФ ссс савляет 977.П р и м е р 5. Фр;:ентный препарат выделяют иэ 1 дО г клеток Е.со 11 МКЕаналогично примеру 2, за исключением того, что использу;от декстран и ПЭГ в концентрациях 2 и 127 со" ответственно, Ферментный препарат иммобилизуют на амт., чтплцеллилозе, активированной глу а,.овым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 90 г ИФП. Выход УТФ составляет 89 Е.П р и м е р 6. Ферментный препарат вьщеляют иэ 100 г клеток Е.со 11 МКЕаналогично примеру 1, эа йсключением того, что используют декстер ран и ПЭГ в концентрациях 1,4 и 97 соответственно. Ферментный препарат иммобилиэуют на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом, В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 100 г ИФП. Выход УТФ составляет 987.П р и м е р 7. Ферментный препарат выделяют иэ 50 г клеток Е.со 11 В, инфицированных фагом Т 4 ащ У 82, аналогично примеру 1, эа исключением того, что используют декстран и ПЭГ в концентрациях 0,8 и 47 соответственно. ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г дезоксиаденозинмонофосфата 0,81 г дАТФ, загружают 60 г ИФП. Выход дАТФ составляет 927П р и м е р 8. Ферментный препарат выделяют иэ 30 г клеток Е.со 11 МНЕаналогично примеру 1. Ферментный препарат иммобилиэуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом.В реакционную смесь, содержащую 5 г цитидинмонофосфата, загружают 30 г ИФП. Выход ЦТФ составляет 65 Х,П р и м е р 9, ферментный препарат вьщеляют иэ 30 г клеток Е.со 11 В, инфицированных фагом Т 4 ав У 82, аналогично примеру 1, иммобилизуют КФП на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом.В реакционную смесь, содержащую 5 г деэоксигуанозинмонофосфата, загружают 25 г ИФП. Выход дГТФ составляет 857.9 1493644 Оный или натрийборатный буфер рН 7,5- вированной матрицы используют ами 7,8. нопропилсилохром или аминоэтилцеллю 3. Способ по п.1, о т л и ч а ю - лозу, активированные глутаровым аль"щ и й с я тем, что в качестве акти дегидом. 7блкц1 кого телеке ккстотм ограбегеескаа одкородеостъ1 одерка ее ослоэкого акоста, 2 осакдеакк Са 1 Ь 1 о- "1оее" 2 Н НС 1-этакол Неталол" клеток 2 Н НС 1-этадол 2 Я НСтэтакол 2 Н ВСЪ этааол Натекал-акетоа 2 Н НС 1-этакол 2 Н НС 1 "этакол ДИЬ ВС 3 дтть ис 1 дгть вс 1 дВЬ ВаСЬ 95Ь 5-9 г ЬО 65 63Ь 2 9 о 560е 93 92Ф 97 1 2 97 95-1 ОО 97 995 99 95-9 Ь 96 И ИС 3 ВС 2 вс 1 95. 9995 а система 1 дкоксек - каоорощщоэвй О:1 Ь:Е 913 Ои 20:3713" 5 Н аееактат аею 2дкоксаа - кэоороокловйэктм кэ каталогов ткеэам Н метет амвеи а б Выход про Кратность использования ИФП укта в синтезе,7 отово та,и 8 9 95 95 6,5,абли Выхвте д п Продукт П Соотношение субстратИФП Концентра ПЭГ; декс рана, 7. вого продукта,ЦТФдТТФУТФдГТФ 8 1 ГТФ 2 дТТФ 3 дЦТФ 4 УТФ 5 УТФ 1,2; 7,02; 12 1,4; 9,0 00 99 97 98 97 96 97,596975979696,59697