Способ очистки ферментных препаратов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик21) 2178099/04 9.09.7 с присоединением заявкиГосударстеенный комитеСовета Министроа СССРоо делам изобретенийи открытий(45) Дата опубликования описания 23.06.) Авторы изобретен М. Степанов, С. В. Беляев, Л. Ф. Матяш, Т, Л. Воюшина и Т. А. Соловье есоюзный научно-исследовательский инсппут генетики и селекции промышленных микроорганизмов 71) Заявитель 54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВпособе очистки енные носители этиламиноэтилметилцелл юлоза нообменные ма. ообменные смоемые для очист.ее эффективные зводные целлюИзобретение относится к способу получения, высокоочищенных ферментных препаратов, кото.рые могут найти применение в пищевой, медицинской и микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике, Эти 5 ферментные препараты могут быть использованы, в частности, в таким процессах, как производство сыров, соков, вин или медицинских сывороток.В литературе описано большое количество способов очистки ферментов 1 . Наиболее рас 10 пространенным и удобным методом очистки фер. ментов является метод жидкостной хроматогра. фии, заключающийся в адсорбции растворенных ферментов на носителе, отделения от носителя с применением солевых буферных растворов, с по следующим обессоливанием раствора очищенного фермента, например, диализом. При этом в общем случае прочность связывания фермента с носителем определяется многими физико - химическими особенностями фермента, характером и расположени ем заряженных групп, степенью диссоциации при данных условиях, размером молекул и т.д. и степень очистки фермента зависит не только от условий разделения, но и от типа применяемого носителя - адсорбента. 25 Наиболее широко при таком с ферментов используются ионнообм на основе целлюлозы, такие, как ди целлюлоза (ДЭАЭ-Ц) и карбокси (КМ - Ц). Известны и другие ион териалы такие, как, например, ионн лы типа Абмерлит, Дауэкс, применя ки некоторых белков, однако, мен для большинства белков, чем прои лозы,Известен, в частности, способ очистки ферментов с применением в качестве носителя ДЭАЭ.Ц 2 2. Однако этот способ обладает рядом существенных недостатков, Во-первых, материал носителя часто оказывается нестоек к отдельным компонентам исходного ферментного препарата и загрязняет очищенный фермент продуктами распада. Во-вторых, материал носителя легко подвергается дейст вию микроорганизмов. В-третьих, все известные материалы на основе целлюлозы при работе в колоночном варианте обладают высоким гидро- динамическим сопротивлением. Это обстоятельствс приводит к длительным операциям с растворами ферментов, снижая выход активного фермента, 551339Предлагается способ очистки ферментных нрепаратов путем ионообменной хроматографии наширокопористых адсорбентах на основе двуокисикремния, например силохромах, которые для избирательного действия на ферменты и сопутствую бщие им примеси и белки модифицируют различными реагентами, содержащими ионогенные группы.В общм случае способ осуществляют следующим образом.Раствор неочищенного фермента вводят в кон 10такт с адсорбентом на основе двуокиси кремниякоторому .;приданы необходимые свойства путемобработки его химическими реагентами, Выборреагентов дпя модификации адсорбентов на основедвуокиси кремния проводят, исходя из известных 111или предполагаемых физико. химических свойствбиологического объекта, подлежащего выделению,и сопутствующих ему приме.ей (изоэлектрическаяточка, полярность и т.п,).Установлено, что модифицированный снлохром, щсодержащий анионогенную аминогруппу (аминоси.лохром), способен избирательно связывать кислыепротеиназы такие, как пепсины и химозины, причемоптимальное связывание указанных ферментовпроявляется при рН исходной среде выше изоточки Ифермента, например дпя пепсина при рН 2,4 - 6,0,дпя химозина при 4,6-6,0.Модифицированный силохром, имеющий ка.тионогенную сульфогруппу алкил/ария/ сульфокис.лоты, обладают избирательным дествием на нейгральные и щелевые протеиназы, оптимум действияпри рН 6,0-8,0,Таким образом, используя избирательностьвзаимодействия модифицированного силохрома набилологически активные вещества, можно производить разделение ферментов и их отделение отпримесей.В качестве элюентов используют растворы со.лей, кислот и т.д в воде или органических растворителях. 40Установлено, что оптимальные условия дпяэлюции кислых протеиназ создаются при применении буферов с рН ниже изозлектрической точкиферментов - дпя пепсина с рН 1,5-2,4 и дляхимозина с рН 2,0-4,5, 45Используя буферы с различным рН в пределах1,5-6,0, можно произвести разделение различныхвидов кислых протеиназ, Данный способ позволяетне только очищать ферменты от сопутствующих импримесей, но и в ряде случаев позволяет разделять 50родственные ферменты, например пепсины и химо.зины, субтилиэины.Пепсины и химозины относятся к кислым протеиназам, поэтому прн обработке их смеси аминосилохромом адсорбируются оба фермента. Дпя их Мразделения применяют последовательно элюзию5. мм (рН 2,4) и 50 мм (рН 1,5) растворами соляной кислоты. Первая фракция элюата (рН 2,4-4,5)содержит фермент химознн; вторая фракция элюата (рН 1,5-2,4) - фермент пепсин. 60 Дпя разделения таких протеиназ, как трипсин и субтилизины, их сорбируют на сульфосипохроме при рН 6,0-8,0, а элюцию ведут, используя буферы: дпя трипсина с рН 3,0-5,0; суьтилизина - с рН 8,0-12.Таким образом, создавая оптимальные условия дпя адсорбирования и элюции того или иного фермента, можно обеспечить высокий выход продукта высокой степени чистоты при сохранении его высокой активности.Очищенный фермент можно использовать в виде раствора или высушенным. Высушивают фермент лиофильно. Дпя сохранения активности фермента при лиофильной сушке раствор очищенного фермента обрабатывают анионитом дпя удаления из раствора кислоты.На фиг. 1 и 2 приведены хроматограммы двух процессов - очистки коммерческого препарата свиного пепснна на аминосилохроме и очистки и разде. пения на аминосилохроме пепсина и химозина из коммерческого препарата, полученного из желудков телят (сплошная линия - оптическая плотность элюата с хроматографической колонки с аминосилохромом, измеренная детектируюшим устройст- вом при длине волны света 280 нм; пунктирная линия - изменение рН элюата; точки - измерение удельной активности, измеренной по скорости гидролиза гемоглобина в фракциях элюата; стрелки - последовательность смены элюентов: 1 - промывка колонки с адсорбированными на ней ферментами исходным буфером, 2 и 3 - начало пропускания через колонку 5 мм и 50 мм соответственно раство. ров кислот, Максимумы оптической плотности на фиг. 1, обозначенные буквами, соответствуют: А - примесям, не адсорбированным колонкой и смытым исходным буфером; Б - примесным пигментам и белкам, десорбируемым:. с колонки буфером 2 и В - ферменту пепсину, десорбируемому с колонки буфером 3 и обладающему высокой протеолитической активностью (Д). Максимумы опти. ческой плотности на фиг.2 соответствуют:А - примесным белкам и пигментам, не адсорбированным на колонке и смытым исходным буфером; Б ферменту химозину, десорбируемому с колонки буфером 2, и В - ферменту пепсину, десорбируемому с колонки буфером 3. Максимумы плотности Г соответствуют примесям, которые десорбируются с колонки при ее регенерации 1 М раствором соляной кислоты. Участки хроматограммы на фиг,2, выделенные вертикальной штриховкой, показывают удельную активность фракций элюата, определенную по створаживанию молока, и соответствуют максимумам оптической плотности. Наибольшая удельная активность (Е) соответствует максимуму (Б), т.е. фракции, содержащей фермент химозин, В указанных условиях достигается высокая очистка и четкое разделение ферментов, обаацающих соответствующими им высокими активностями (Д и Е) .В примере 1 приведен способ очистки свиного педсмна на немопифицированном силохроме марки19 15 И ЗЬ С.80, Из сравнения удеяъюй активности ферментов, очищенных по способам, приведенным в примерах 1 и 2 (примере 2 для очистки свиногопепсина использован аминосилохрсе - модифицированный сило хром, содержащий иовЗгеиныеаминогруппы), видно, что модификация приводитк избирательному действию носителя на очищаемыйфермент (с л, фиг. 1),П р и м е р 1. Очистка пепсина на силохроме,Буферный раствор с рН 3,0 - 6,0 (целесообразно3,5-5,5)содержащий неочищенный свиной пенсии судельной активностью около 19 единиц активности,(оптическую единицу (е.а./о.е.) пропускают черезхроматографическую колонку, заполненную силохромом марки С - 80. Затем адсорбент промываютпоследовательно исходным буфером 5 мм и 50 ммрастворами соляной кислоты (НС 1), Собираютфракцию элюата с колонки с рН 1,5 - 214. Удельнаяактивность пепсина в указанной фракции составля.ет 25 - 30 е,а./о.е.П р и м е р 2. Очистка пепсина на аминосилохроме. Хроматограмма процесса очистки представлена на фиг. 1,Буферный раствор с рН 3,0 - 6,0 (целесообразно5,4), содержащий неочищенный свиной пенсии судельной активностью около 15 - 30 е.а /о.е. пропус.кают через хроматографическую колонку, заполненную аминосилохромом (модифицированным силохромом, имеющим анионогенную аминогруппу),Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером (1) 5 мМ (2) и 50 мМ (3) раствора.ми НС 1. Собирают фракцию элюата с колонки с рН1,5-2,4. Удельная активность йепсииа в указаннойфракции, определенная по методу Ансона, состав.ляет 60 - 75 е,а,/о,е, Перед лиофилизацией растворфермента обрабатывают ионитом марки АВ17 - 8/АВ 16 ГС, Дауэкс 1 х 16 и т,п./ в ОН - илиСНт СОО - форме, увеличивая рН раствора до2,5-6,0, целесообразно 3,5.5,5. Выход фермента поактивности после лиофилизации составляет около70-80%,П р и м е р 3, Очистка и разделение пепсина ихимо зина.Хроматограмма процесса представлена нафиг.2,Буферный раствор с рН 4,5 - 6,0 (целесообразно5,4), содержащий ферментный препарат, полученный иэ желудков телят, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную аминосилохро.мом. Затем адсорбент промывают последовательноисходным буфером5 мМ (2) и 50 мМ (3)растворами НС . Собирают фракции элюата с рН 2,4. 4,5 и 1,5 - 2,ч. йервая фракция содержит срерментхимозин (молокоствораживающий фермент) судельной активностью, определяемой по створаживанию молока, равной 30000 ед. активности намиллиграмм фермента (е,а./мг). Вторая фракциясодержит лепсин желудка телят и обладает претсо 1литической активностью, определяемой по расщеп.,лению гемоглобина (метод Лисона), равной 20-30 а.е./о.е. Профиль кривой элюзни с колонки приве. дон на фиг.3. Перед лиофилизацией указанные фракции обрабатывают иопитами марки АВ 17 -8/АВ 16 ГС, Даузкс 1 х 16 и т,п./ в ОН- или СНзСОО-форме. Выход химозина по активности составляет около 80%,П р и м е р 4. Очистка субтилизина на амино. силохроме.Буферный раствор, рН 6,0 - 11,0, целесообразно 6,0- 8,0, содержащий фермент субтилизин,пропускают через колонку, заполненную аминосилохромом. Элюат с колонки содержит свободный от сопутствующих пигментов и других примесей субтилизин с активностью в 815 раз выше исходной, определяемой по расщеплению синтетического Субстрата и-нитроанилида карбобензоксиглицил - глицил - л - лейцина,П р и м е р 5. Очистка и разделение субтилизинов на сульфосилохроме.Буферный раствор с рН 6,0- 11,0, целесообраз. но 6,0. 8,0, содержащий субтилизин, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную сульфосилохромом - модифицированным силохромом, имеющим катионогенную сульфогруппу алкин 1 арил/сульфокислоты. Затем адсорбент промы. вают последовательно исходным буфером с рН 6,0-8,0 и буферами с рН 8,1 . 9,0 и 10-11, Собирают фракции элюата с колонки с рН в пределах 8,0- 11,0, содержащие практически чистый субтилизин, свободный от примесных белков и пигментов.П р и м е р б. Очистка трипсина на сульфосилох роме.Буферный раствор с рН 6,0.8,0, содержащий тринсин, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную сульфосилохромом. Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером и 1 мМ раствором НС с рН 3,0. Собирают фракции элюата с колонки с рН 3,0- 5,0, содержа. щие высокоактивный трипсин, по данным элсктрофореэа, свободнь:й ог сопутствующих примессй и белков. Примеси элюируются с колонки при после. дующей ее промывке 1 О мМ раствором щелочи или1,0 М раствором НС 1.П р и м е р 7, Очистка иммуноглобулинов,Буферный раствор, рН 6,0-9,С целесообразно,0,05 М фосфатный буфер с рН 7,0.8,0, содержащийпрепарат пчацентарного человеческого иммуноглобулина, пропускают через колонку, заполненнуюаминосилохромом. Элюат с колонки при промывкеее исходным буфером содержит практически чистый плацентарный иммуноглобулин. Примеси элюируются с колонки при последующей ее промывке 10 мМ раствором щелочи или 1,0 М раствором, соляной кислоты,чо р мул а изобретения 1, Способ очистки фсрментных препаратов путем адсорбции растворенных ферментов нз носиге551339 2,0 1500бьем злата, мп.Фиг.ле с последующим отделением от носителя с приме .нением солевых буферов, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что с целью получения ферментов высокой степени чистоты при сохранении их высокой активности, обеспечения высокого выхода продуктаи сокращения времени очистки, в качестве носителя используют вещества на основе двуокиси кремния, например с:щохромы, модифицированные реагентами и содержащие ионогенные группы для избира. тельного связывания ферментов. и сопутствующих им примесей.2. Способ по п. 1, оли чающийся тем, что для избирательного связывания ферментов и сопутствующих им примесей применяют однокрах. ное или последовательное адсорбирование на силохромах, модифицированных реагентами и содержа. щих различные или одинаковые ионогенные груп пы, а отделение от носителя производят путем применения одного или нескольких буферов.3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что для избирательного связывания таких ферментов, как кислые протеиназы, например пепсины и химозины, из веществна основе двуокиси кремния, используют вещества, содержащие анионогенные группы, например амнносилохромы.4. Способ по п.ц. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й. с я тем, что для избирательного связывания таких ферментов, как щелочные и нейтральные протеина. зы, например субтилизины, з веществ на основе двуокиси кремния используют вещества, содержащие катионогенные группы, например сульфосилохромы.5, Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что, кислые протеиназы, такие, как различные пепсины, адсорбируют на носителе при рН исходно.го раствора 2,4-6,0, а отделяют от носителя, применяя буферыс рН 1,5-2,4. Ь 6, Способно пи. 1-3, отличающийся тем, что кислые протеиназы, такие,как различные химозины, адсорбируют при рН исходного раствора 4,5-6,0, а отделяют от носителя, применяя буферы с рН 2,0-4,5,10 7. Способно пп. 1,2,3,5,6, отличающичсятем, что для: очистки и разделения кислых протеи.наз, например, таких, как пепсины и химозины, ихадсорбируют на носителе и затем отделяют от;носителя последовательно путем применения нес,кольких буферов с рН 1,5.4,5.8 Способпопп. 1 и 4,отличающий ся тем,что нейтральные и щелочные протеиназы, такие, кактрипсин и субтилизин, адсорбируют на сульфосилохроме нри рН исходного раствора 6,0-8,0, а отделяют он носителя, применяя буферы. для субтилизинас рН 8,0 12,0 а для трипсина с рН 3,0.5,0,9, Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что дпя избирательного связывания пигментов ибел сов, сопутствующих таким протеиназам, каксубтилизины, последние адсорбируют, применяя вещества на основе двуокиси кремния такие, какнапример, аминосилохром,.30Источники информации, принятые во вниманиепри зкспертизе:1. Степанов В, Н., Грейль Т. И. Биохимия",том 28, стр. 540, 1963 г. (прототип).2. Циперович А. с:. "Ферменты", Техника, Киев,1971 г.551339 Ъ Составитель А. Богароцдактор Н. ЙжагаретгиТехред М. Левицкая Корре Болди жар раж 553 П рственного комитета Совета Ми делам изобрсгеннй и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д 83/1 Ти 1 ИИПИ Госудаак пнсное сгров СССР