Способ определения поливалентного антигена

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК а) 4 С 01 М 33/53 ОПИСНИ ИЗОВРНИК ПАТЕНТУ мьпци. ба. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ П(НТ СССР(71) Берингер Маннхайм ГмбХ (РЕ)(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОГО АНТИГЕНА(57) Изобретение относится к иммунохимическому способу определения антигена в жидкой пробе, Целью изобретения является повышение точности иупрощение способа, 50 нг антител перИзобретение относится к иммунохимическому способуопределения поливалентного, т,е. по меньшей мере бифункционального, лиганда (антигена) в жидкой пробе.Цель изобретения - повышение точ" ности и упрощение способа.П р и м е р 1. Определение тиреотропина (ТБН).Рецептор 1 антитела первого порядка и рецептор 3 (меченые РаЬ-фрагменты антител первого порядка) происходят из одного и того же вида животных (мьппи); рецептор представляет 801475492 А 3 вого порядка и 170 пг/мл меченого(РаЪ)2-фрагмента этого антитела помещают на слой волокнистой массы, состоящей из полиэфирной бумаги размером бхб мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температуре.Далее на этот носитель помещают определяемый антиген, центрифугируют инадосадочную жидкость соединяют сантителами второго порядка, связанными с твердой фазой и специфичнымик РС-фрагменту антител первого порядка. После инкубирования реакционнойсмеси ведут определение антигена поиндикаторному реактиву в иммуноферментном анализе. Точность способавозрастает за счет повышения чувствительности иммуноферментного анализадо 40 пг/мп. Упрощение достигаетсятем, что первое антитело и меченоеантитело могут быть получены от одного животного. 2 табл. 2собой маркированный РаЬ-фрагмент. Рецептор 1 представляет собой моноклональное антитело, РаЬ-фрагмент в рецепторе 3 также происходит из моноклонального антитела, которое ,направлено против другого детерминанта ТБН, , чем моноклональное антитело рецептора 1, Рецептор 2 происходит из овцы и направлен против Рс-части моноклонального антитела Реактивы для осуществления спосо 1475492Инкубационный буфер (1 Р): 15 ммоль натрийфосфатного буфера, рН 7,14, 154 ммоль ИаС 1, 5 ммоль ЕРТА, 0,2 Е ТБА, рН 7,4.Рецептор 1 (антитела первого порядка); анти-ТБН - антисыворотка мьппи (рецептор 1). Содержащая моноклональные анти-ТБН-антитела асцитная жидкость из,мьпдей смешивается с коли чеством до 1,8 М с (ИН)2 БО. Осадокрастворяется в буфере из 15 ммоль Фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль МаС 1 и таким образом полученный раствор подвергается пропусканию через 15 . РЕАЕ-целлюлозу.Рецептор 3 (меченые антитела); Анти-ТБН-антитело (моноклональное), которое распознает другой антигенный детерминат, чем рецептор 1. Конъюгат 20 пероксидазы (рецептор 3)ф мышиная анти-ТБН-антисыворотка очищается как рецептор 1. Последующее получение (РаЬ): из комплектной молекулы антитела осуществляется аналогично. 25 Связывание с пероксидазой хрена.Рецептор 2 (антитела второго порядка): адсорбирующий материал с фиксированным овца-анти-мышь Гс - анти- телом (рецептор 2-адсорбер). Овечья антимьддиная Рс-антисыворотка смешивается с количеством до 1,8 М с ИНБО. Осадок растворяют в буфере 1 ил 15 ммоль Фосфата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль МаС 1 и таким образом по" лученный раствор пропускают через РЕАЕ-целлюлозу. Содержащую 1 аС-фракцию (рецептор 2) связывают с адсорбентом, средства, активированным глутаровым альдегидом Воспг 3.пдег Мапп йехтп. Индикаторный реактив: 1,8 ммоль АВТБ 2,2 -азино-ди(3-этилбензтиазолинсульфонат-б), 3,3 ммоль пербората натрия в 100 ммоль фосфатно-цитратного буфера, рН 4,4.Способ осуществляют следующим образом.50А. 50 нг. рецептора 1 и 170 пг/мп рецептора 3, растворенные В цнкубационном буфере, накалывают вместе на прочее (слой волокнистой массы), состоящий из полиэфирной бумаги размером бхб мм, толщиной 1,0 мм, и высушивают при комнатной температу 55 ре, Содержащее этот реактив бумажное полотно называется реактивным носителем 1.На реактивный носитель 1 наносят пипеткой 40 мкл определяемой пробы, содержащей известное количество антигена стандартного раствора, затем прочес (слой волокнистой массы) тотчас отделяют центрифугированием в центрифуге ЕррепйогГ, причем реактивный носитель 1 размещается на Еррепдогй колпачке, а элюированная жидкость в колпачке (Нсйеп) во время центрифугирования попадает на рецептор 2, который связан с адсорбером, и реагирует с ним. Из рецептора 2 используется 2,5 мг адсорбированного материала на тест.На аппаратуре со встряхиванием инкубируется реакционная смесь в течение 15 мин при 37 С.Спустя 15 мин реакционные сосуды вынимают из аппаратуры и центрифугируют.Отбирают аликвотную часть надоса" дочной жидкости с помощью пипетки и определяют образовавшийся краситель по его экстинкции при 405 нм.С помощью двух различных ТБН-проб определяются следующие значения экстннкции, приведенные в табл,1.Т а блица 1 ТБН, О Мп 0 50+Значения экстинкции определялисьпри толщине слоя 0,2 см и пересчитывались на толщину слоя 1 см.,Б, Простой Сэндвич (сравнение).Осуществляют по А, но 2,5 мг адсорбера - рецептора 2 предварительноинкубируется в течение 1 ч с 20 мкгрецептора 1 в 0,2 мп при встряхивании. Затем надосадочная жидкость отсасывается и остаток промывается трижды по 1 мл 1 Р,Таким образом предварительно обработанный рецептором 1 адсорбер-рецептор 2 инкубируется 4 ч с пробойи рецептором 3 в аппаратуре со встряохиванием при 37 С, причем в этом варианте отпадает добавка растворимогорецептора 1.Затем надосадочная жидкость отсасывается, остаток промывается и фиксированная активность фермента определяется с помощью индикаторного реактива.514754С помощью двух различных ТБН-проб определяются следующие величины экстинкции, приведенные в табл.2,Таблица 25 Е, нм/см ТБН, ро Мп 0,20 2,87 0 5010 30 Чувствительность значительно меньше, чем согласно п.А,.хотя в п.Б используется значительно больше рецептора 1, чем в п. А (соотношение15 1:400) .П р и м е р 2, Определение человеческого хориогонадотропина (НСС).Реактивы.Буфер А: 100 ммоль фосфата натрия, рН 7,3 (37 С), 2 ммоль хлорида магния, 0,97 МаС 1, 0,57. КБА (альбумин сыворотки крови крупного рогатого скота).120 мкг/мл анти-НСС моноклональ ного антитела из мыши в виде асцита (рецептор 1)..100 пг/мл (мп анти-НСС-антитело - (овца) - ГаЬ;-фрагмент- -галактозидаза - конъюгат) рецептора 3.Приготовление РаЬ-фрагмента осуществляется согласно Т,Кеа 8 аа.Ковалетное связывание Р -галактозидазы с антителом, соответственно с АК-фрагментом, осуществляется по методу К.Р.Розег.Субстратный раствор: как и буфер А, дополнительно содержит 5 ммоль (ОИРС) орто-нитрофенилгалактозида.Приготовление реактивного носителя 1 осуществляется аналогично приме- меру 1. 40 мкл раствора А накапывают на слой волокнистой массы (прочес), состоящий из полиэфирной бумаги, и затем высушивают при комнатной тем 45 пературе. Хранение слоя волокнистой массы (прочеса) вплоть до его использования осуществляется при 4 С и относительной влажности воздуха 6 20 Ж.Приготовление реактивного носителя 2 на целлюлозном прочесе (слое волокнистой массы) по способу активирования бромцианом фиксируется (М - Гс) -антитело овцы (1 С-фракция), причем на 1 г волокнистого материала для фиксации берется 10 мг антитела. Путем промывки удаляется несвязанное антитело, и прочес (слой волокнистого материала) осторожно высушивают 92 ьпри комнатной температуре, Хранение волокнистого материала (прочес) осуществляется аналогично реактивному носителю 1.Определение НСС осуществляют с помощью реактивных носителей 1 и 2 описанным в немецкой патентной заявке Р 24250085 устройством. Устройство для осуществления аналитических определений включает роторный вставной элемент для центробежных (центрифужных) аналитических автоматов, состоящий из формованного корпуса, который имеет камеру для ввода пробы, связанную с множеством реактив,ных областей, содержащих пропитанный определенным реактивом всасывающий носитель, по крайней мере одну. камеру со смесительным клапаном и измерительную камеру, которые вместе образуют транспортировочный путь испытуемой жидкости (жидкости пробы), который идет радиально изнутри до, далее радиально наружу, когда вставной элемент укреплен на роторе, и далее, по крайней мере одну-две камеры для приема жидкости, и транспортировочный путь, который ведет из этой камеры к осуществлению измерения и идентичен по меньшей мере частично транспортировочному пути испытуемой жидкости. При этом транспортировочный путь испытуемой жидкости идет от камеры для ввода пробы (Р) через заполненную поглощающим материалом содержащую буфер камерун., камеру С и расположенную между камерами р и с первую клапанную коробку 7 КУ, к второй клапанной коробке ЧК и из нее через камеру 1 и через приемную камеру АК в измерительную камеру К. Для принятия дальнейшей жидкости предусмотрена камера, выполненная в виде насосной камеры, для субстрата РК, которая через состоящее из дозировочной камеры ДК и капилляра Кар дозировочное устройство и переливную камеру ОК связана с второй клапанной коробкой 7 К 2.При этом реактивный носитель 1 помещается в поле с вставного элемента, а реактивный носитель 2 - в поле д . Осуществление реакции соответствует примеру 1. При этом пипеткой вносят 40 мкл пробы через отверстие в верхней части края непосредственно в поле о . Проба неразбавленная. Высокая скорость вращениячередуется с состоянием покоя, затемпроба и субстрат движутся в направлении разделительной матрицы и кюветы.Перенос пробы из поля с в д осу 5ществляется в течение очень короткоговремени ( 60 с). Ведущий в конечном счете к индикации объем субстрата составляет также 40 мкл, так чтоникакого разбавления пробы до измерения сигнала не происходит,При применении калибровочной сыворотки получается калибровочная криВая, которая охватьвает область 0100 пг/мп НСС (мп) стандартизованно 15по 1-му 1 КР-стандарту для НСС, .и становится возможным достаточно чувствительное измерение НСС .в сьворотке иплазме.П р и м е р 3. Определение альфа1-Фетопротеина (АРР),Применяют маркированный гаптеномрецептор 1, причем все три антителапроисходят из одного и того же виДаживотных 25Осуществление и используемый буферсоответствует примеру 2.В качестве рецептора 1 используются анти-АРР-антитело, овцы (100 нг/мл),которые маркированы дигоксином (согласно патенту фРГ Р 2537129), в ка.честве рецептора 3 используютсяанти-АРР - антитела овцы, маркированные 5 -галактозидазою согласнопримеру 2, и в качестве твердофазносвязанного рецептора 2 применяютсябумажные диски из полиэфирной бумаги, с которыми адсорбционно связывают антитела против дигоксина овцы.Способ нанесения покрытия соответствует известному для пластиковыхтрубочек способу.П р и м е р 4. Определение тиреотропина (ТБН),Реактивы. 45Инкубационный буфер (1 Р); 15 ммольнатрийфосфатного буфера, рН 7,4,154 ммоль ИаС 1, 5 ммоль ЕДТА, 0,27РБА, рН 7,4.50Рецептор 1: овечья анти-ТБН - антисьворотка. Неочищенная .сьвороткасмешивается с количеством до 1,8 М сУН БО . Осадок растворяется в буфереиз 15 ммоль фосфата натрия, рН 7,0,и. 50 ммоль ИаС 1 и таким образом полученный раствор подвергается пропусканию через ДЕАЕ-целлюлозу. Содержащая 1 дС-фракция затем освобождается от реагирующих с альФа-цепью ТБНчастей путем пропускания через нагруженный НСС иммуноадсорбер. Элюат подается на нагруженный ТБН иммуноадсорбер, После промывки адсорбера происходит элюирование иммунореактивныхпротив ТБН антител с помощью 1 М пропионовой кислоты. Элюат затем диализуется по отношению к 1 Р, при,известных условиях концентрируются путемультрафильтрации.Рецептор .Зе конъюгат антитела -пероксидаза. Дальнейшая овечья антиТБН - антисыворотка очищается какрецептор 1 и затем из нее получают(РаЬ)2 -фрагментов осуществляетсясогласно Е.Еашоуе.Рецептор 2. Материал адсорберас Фиксированным ослиным-антиовечьимРс - антителом. Ослиная-антиовечьяРс -антисыворотка смешивается в количестве до 1,8 М с МЦБ 04. Осадокрастворяют в буфере из 15 ммоль фосФата натрия, рН 7,0, и 50 ммоль МаС 1и таким образом полученный растворпропускают через ДЕАЕ-целлюлозу,Содержащую 1 яс-Фракцию (рецептор 2)соединяют с адсорбентом средства,активированным глутаровым альдегидомВоеЬг 3.пяег МацтДехш (определение665525) по рабочей инструкции изготовителя,Индикаторный реактив: 1,8 ммольАВТБ 2,2-азино-ди(З-этилбензтиазолинсульфонат)3, 3,3 ммоль пербората натрия в 100 ммоль фосфат-цитратного буфера, рН 4,4.Способ осуществляют аналогичнопримеру 1, причем в этом случае 100 нгрецептора 1 и 100 пг/мл рецептора 3,растворенные в инкубационном буфере(40 мкл), накапывают на целлюлозныйпрочес (слой волокнистой массы) размером бх 6 мм. После высушивания хранение прочеса вплоть до примененияего снова осуществляют при 4 С.Дальнейшее осуществление соответствует примеру 1. В качестве пробыиспользуется 40 мкл. Таким образом, предлагаемый способ позволяет точнее определять антигены, содержащиеся в малых количествах (40 пг/мл). Кроме того, достигается упрощение способа, так как не требуется получать первый и третий рецепторы из двух различных видов животных9 1475492 10Ф о р м у л а и з о б р .е т е н и я конкурентным методом по актинностиСпособ определения поливалентного метки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, антигена, включающий добавление его что, с целью повышения точности и к специфическим моноклональным анти- упрощения способа перед добавлением5Утелам или фрагментам антител первого антигена специфические антитела перпорядка, антителам второго порядка, вого порядка и меченые РаЬ-фрагменты связанных с твердой фазой и специфич- этих антител наносят на твердую фазу, ных к РС-Фрагментам антител первого высушивают, далее после добавления порядка, к РаЬ-фрагментам антител 1 О антигена смесь центрифугируют и надпервого порядка, маркированных меткой, осадочную жидкость соединяют с антис последующим определением антигена телами второго порядка.Составитель Г. КрюковаРедактор Н. Тупица Техред М.Дидык Корректор М. ПожоЗаказ 1916/59 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Гасударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101