Способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа

)5 С 01 й 33/ в медицине, сельском хозяйленности для определения биактивных соединений, Целью является ускорение способа за менного определения двух андостигается тем, что в анается иммуносорбент с антитеопределяемым антигенам, а антигенов осуществляют нтител к ним, которые мечены ными металлопорфиринами.свойства используемых пороляют селективно определять х в смеси и по ним определять Регистрацию проводят из обьорбции или непосредственно и твердой фазы, В качестве в могут выступать два зпитопа молекулярного антигена. одам прот быть исмедицине, для опре- соединеудалить из смеси непрореагировавшие компоненты. Внесение смеси двух антител, меченных двумя разными металлорпорфиринами, последующее инкубирование и отмывка сорбента позволяют получить следующие цепочки; твердая фаза - антигенспецифические антитела - антиген-коньюгат антигенспецифических антител с метэллопорфиринами. Концентрация данного металлопорфирина на твердойфазе пропорциональна концентрации того анти- гена, к которому специфичен данный коньюгат антител с металлопорфирином,Для измерения интенсивности фосфоресценции металлопорфиринов осуществляют десорбцию специфически связанных с сорбентом коньюгатов в обьем щелочным раствором или измеряют фосфоресценцию скорени пределе бр з ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗОБРЕ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Институт биохимии им. А, Н. Баха, Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт и Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения(56) Авторское свидетельство СССР В 1464089, кл. 6 01 й 33/53, 1987,(54) СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО ФОСФО РЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (57) Изобретение относится к методам про ведения иммуноанализа и может быть Изобретение относится к мет ведения иммуноанализа и може. пользовано в ветеринарии,биологической промышленности деления биологически активных ний. Целью изобретения является способа за счет одновременного ния двух антигенов в одной пробе Способ осуществляют следуюДля анализа пробы, содержащей одновременно два антигена, используют комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум определяемым антигенам. В лунках панелей происходит связывание антигенов с сенсибилизированными анти- телами, Отмывка лунок панелей позволяет использовано стве, промыш ологически изобретения счет одновре тигенов, Цель лизе использу лами к двум проявление смесью двух а двумя различ Спектральные фиринов позвкаждый из ни два антигена, ема после дес с поверхност двух антигено одного макро 1679382 А40 45 50 раствором или измеряют фосфоресценцию с поверхности лунок после добавления бисульфита (удаление растворенного кислорода), Интенсивность фосфоресценции каждого металлопорфирина измеряют путем смены длин волновозбуждения и (или) регистрации (с помощью монохроматоров ион наборов фильтров с полушириной пропускания 10 - 50 нм),Учет результатов реакции проводят по величинам интенсивности фосфоресценции на соответствующих длинах волн,В табл, 1 приведены спектральные характеристики различных Рб-порфиринов,П р и м е р 1, На поверхность лунок полистирольного микропланшета адсорбировали смесь антител кролика к вирусу ящура типов А и О по 10 мкг/мл из 0,1 мл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,2 в течение 3 ч при 37 С. Затем раствор выливали и промывали лунки 3 раза фосфатно-солевым буфером с Тритоном Х - 100 (0,01 М К-фосфат, рН 7,4, 0,15 М йаС, 0,05% ТХ - 100; ФСБТ),Конъюгаты анти-А-антител с Рб-копропорфирином и анти-О-антител с Рб-тетракис(п-карбоксифенил)порфином получали по методике, описанной в прототипе,В лунки с адсорбированными антителами наливали по 0,1 мл станрастворов коммерческого антигена вируса ящера типа А (производства ВНИЯИ, Владимир) в ФСБТ и инкубировали 1 ч при 37 С, После этого растворы выливали, промывали лунки 3 раза ФСБТ, заливали в них по 0,1 мл ФСБТ, содержащего по 10 мкг/мл обоих конъюгатов антител с Рд-порфиринами (концентрации обоих конъюгатов подбирались в предварительных опытах по параметру максимального соотношения сигнала в опыте и в контроле без антигена). Инкубировали еще 1 ч, после чего снова отмывали лунки 3 раза ФСБТ.Десорбцию меченных соединений проводили 0,01 М раствором КОН, содержащим 0,2 оь ТХ - 100, после чего (через 20 мин)добавляли бисульфит натрия в конечной концентрации 5 мг/мл.Регистрацию фосфоресценции, (возбуждение) проводили азотным лазером (337 нм) с частотой 100 Гц и полушириной вспышки 10 нс. Регистрацию осуществляли последовательно с использованием интерференционных фильтров с максимумами пропускания 670 и 710 нм,5 10 15 20 25 30 35 Время задержки 0,3 мс, счета 0,7 мс, Время накопления сигнала 10 с. Результаты представлены в табл, 2,Из данных табл. 2 определяется типовая принадлежность вируса ящура; сигнал при 670 нм в 3,2 раза выше, чем при 700 нм, В десорбирующем растворе находится только Рб-копропорфирин. Это свидетельствует о принадлежности вируса ящура к типу А, По калибровочной кривой при 670 нм (2-й столбец, табл, 2) определяется концентрация вируса ящурэ типа А (в единицах разведения).П р и м е р 2. Способ осуществляется аналогично примеру 1, но исследуемый образец содержит оба типа антигена вируса ящура. Измеряют интенсивности фосфоресценции при 670 и 700 нм. Затем, решая систему уравнений:16 бо = Х+ Ау,1 тоо = Вч+ у,где А = 1 тоо/166 о для Рб-копропорфирина, а В = 1660/1 тоо для Ро-тетра(п-карбоксифенил)порфина, коэффициенты, определяемые из табл. 2 и 3, равные соответственно 0,26 и 0,31), определяют интенсивность свечения Рб-копропорфирина (Х) и Рб-тетра(пкарбоксифенил)порфина (Ч). Затем по калибровочным кривым из примеров 1 и 2 по интенсивности свечения определяют концентрации антигенов типа А и типа 0 вируса ящура,Способ позволяет одновременно определить 2 антигена в случае ограниченного количества исследуемого образца. Формула изобретения Способ твердофазного фосфоресцентного иммуноанализа, включающий получение антител, ковалентно меченных металлопорфиринами, десорбцию меченного соединения после проведения иммуной реакции на сорбенте, и определение интенсивности фосфоресценции раствора, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения способа за счет определения двух антигенов в одном образце одновременно, используют комбинированный иммуносорбент, содержащий антитела к двум антигенам, меченные двумя различными металлопорфиринами, а определение антигенов ведут последовательно по интенсивности фосфоресценции соответствующего металлопорфирина,1679382Таблица 1Таблица 2Составитель И.Башкаев Редактор А.Шандор Техред М,Моргентал Корректор О.Кравцова Заказ 3210 Тираж Подписное8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101