Способ определения аргинина

СООЗ СОВЕТСКИХСООИАЛИСТИЧЕСНИХРЕС УБОИН 80139780 А 1) 4 ю 01 И 21/7 ННЫЙ КОМИТЕТ СССР ОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ОСУДАРСПО ДЕЛ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ А ВТОРСКОМУ ЕЛЬСТВУ В 19дицинский и иту(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АРГИНИНА(57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к определенив аргинина (Аг 8)в смеси аминокислот. С целью повьппения специфичности определения и упрощения способа анализируемый раствор предварительно нейтрализуют до рН 6,9-7,1,затем добавляют хлороформ. Полученнуюсмесь обрабатывают раствором бромтимолового синего с рН 4,0, перемешивают до стабильности окраски. Послерасслоения фаз отделяют хлороформный слой, обрабатывают часть его0,1 М раствором ХаОН, а после расслоения смеси фотометрированию подвергают водный слой. Процент открытия добавленного Аг 8 находится в пределах 94,4-1007, 6 табл,1397808 1 О 15 Таблица3,0 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0 6,0 РН раствора Оптич,плотность 0,05 0,24 0,37 0,30 0,40 0,38 0,24 0,23 0,20 аргинина Изобретение относится к биохимическим методам исследования и может быть использовано при определении аргинина в смеси аминокислот, например в лекарственной смеси "Альвеэин" или искусственных питательных средах.Цель изобретения - повышение спе-, цифичности определения и упрощение способа.Способ осуществляется следующим образом.Реактивы: 0,053-ный водный раствор бромтимолового синего с рН 4,5 (для доведения значения рН до 4,5 используют 0,01 М НС 1)1 хлороформ; О, М раствор гидроксида натрия. Смесь аминокислот "Альвезин" доводят по рН-метру до рН 7,0 (исполь п зуют 0,01 М раствор НС 1 или 0,01 М раствор гидроксида натрия). Отбирают пробы с примерным содержанием аргинина 0,12 - 0,6 мкмоль, прибавляют 3 мл хлороформа и 2 мл 0,053-но го раствора бромтимолового синего с рН 4,5. Перемешивают пробы перевоПеремешивание смеси аминокислот, 40 хлороформа и раствора бромтимолового синего ведут до образования постоянной окраски хлороформного слоя, что свидетельствует о полном извлечении гидрофобного комплекса аргинина и 45 бромтимолового синего в хлороформ.Эту операцию можно контролировать визуально по отсутствию нарастания желтой окраски хлороформного слоя при перемешинании, 50Перемешивание ведут путем переворачивания пробирок, избегая вспенивания проб, поскольку это приводит к завьццению резупьтатов. Экспериментально установлено, что для полного извле 55 чения комплекса аргинин-бромтимоловый рачиванием пробирок (40 переворачияаний),После полного расслоения Фаз отбирают из хлороформного слоя (нижней Фазы) 2 мл окрашенного в желтый цвет раствора и перенося г в другую пробирку, содержащую 3 мл 0,1 М раствора щелочи, и встряхивают до полного обесцвечивания хлороформного слоя После полного расслоения отбирают окрагценный в синий цвет верхний слой и фотометрируют при 590 нм в кювете с длиной светового пути 1 см иа спектроФотометре или колориметре против хо- лостой пробы (которую готовят так же, но вместо смеси аминокислот обрабатывают такой же объем воды).Зависимость чувствительности способа определения аргинина от значении рН раствора бромтимолового синего приведены в табл,1.0,053-ный раствор бромтимолового синего должен иметь значение рН н пределах 4,0-4,6, поскольку в этом интервале значений рН достигается максимальная чувствительность метода (табл.1) . синий в хлороформ необходимо ие более40 переворачиваний пробирок. Обнаружено также, что гидрофобный комплексаргинин-бромтимоловый синий полностьюпереходит в хлороформный слой и в том случае, если пробы, не перемешивая, оставить на сутки и более. Специфичность определения аргинина по предложенному способу была проверена по отношению к ггругим аминокислотам при различных значениях рН раствора бромтимоловогр синего (табл.2). Иэ табл.2 следуе, ч:о в укаэанных условиях определения метод практически полностью специфичен для1397808 Т а б л и ц а 2 Оптическая плотность при различныхзначениях рН раствора бромтимоловогосинего Аминокислоты 4,5 4,6 4,4 0005 0,007 0,006 0,01 Лизин 0,009 Нор-валин 0,01 0,006 0,0 0 Цис теинОрнитинТриптофанАлании 0,008 Гистидин 0,016 0,016 Валин 0 Серии Нор-лейцин 0,0020,004 0,005 Глутаминовая кислота Фенмлаланин 0,0080,004 Аспарагин Глутамин Лейцин 0,005 О, 010 0,001 0,008 Аспаргиновая кислота 0,002 0,004 0,0 О Глицин ПролинМетионин 0,012 Треонин О, 014 0,381 0,022 0,408 Бета-алании 0,366 0,398 Агни П р и м е ч а н и е. Растворы аминокислот доведены 0,0 М растворомедкого натрия до рН 7,0. Для исследования взятыпробы аминокислот, содераащие по 0,6 мкмоль каждой аминокислоты,О, 015 0,015 0,010 0,012 О, 015 О, 010 0,0090,009 0,010 0,006 0,01 О, 001 О, 002 О, 008 О, 011 О, 009 0,002 0,002 0,004)397808 Таблица 4 Оптическаяплотность Ко ванче с тв о а ргчнина мкмоль мкг 0,090 0,170 0,260 0,350 0,32 0,24 20,9 41,8 Т а б л и ц а 3 62.8 Параметры тичрская плотчость 0,48 83,8 и оооб 104,7 0,430 О 60 Х - О, 486 0,500 0,500 Я - О,О 04 0,46 П 0,505 0,455 0,495 о яг 3 О Содержаниеаргинина предложенным женчя способом о н и е; Х-Грепияяаримети- ческая У3,3 г/л 3,15 г/л 95,4,ощчбка. Я - соепняянапоатчческая ошибка.Ч - оэср)ициВоспроизнодимость метода опоедеенчя аогичина пронеоена при паоалельных опрепеленчях одной ч той же прМы (0,7 мкдол ) аргинина (табл.3) Плученные дйнные снипетельстнуит с достаточно хороших метрологических -раметоах способа опоедгления аргиит а (низкий оазбосс данных в парал.-:; 1 ьных определениях) ент вариации.Чувствительность метода определения аргинина н указанных условиях составляет 0,12 мкмоль аргинчна. Линейная зависимость межцу количеством аргчнина и оптической плотностью расайвора сохраняется н диапазоне концеитраций 0,12-0,6 мкмоль (табл,4)чо достаточно пля постооенчя калибровочной кривой,)озможность опрепеления аргининан присутствии дрчгих аминокислот была проверена также на искусственнопоиготонленной смеси аминокислот илекарственной смеси аминокислот"Альнезин", к которым добавляли известные количества аргииина, Определение аргинина н лекарственнойсмеси Альнеэин" (препарат как указано в рецептуре, содержит 3,3 г/лаогинина) представлено н табл,5.Т а б л и ц а 5 Обиаоужено 7 обиару 40 Определение аргинина в смеси аминокислот при добавлении изнестныхколичеств аргинина в искусственнуюсмесь аминокислот в 25 мл воды растнооили 200 мкмоль лизина, нор-валина, цистеина, орнитина, триптофана, аланина, гисидина, валина, серина, нор-лейцина, глутаминоной кислоты, фенилаланчча, аспарагина, лейпина, иэолейцина, глутамина, аспарагиновой кислоты, глипчна, пролина, 50тоеонина н метиончна) или в лекарственную смесь аминокислот Альнезин"препставлено в табл,6.1 397808 Таблица 6 Смесь аминокислот "Альвезин" Смесь аминокислот 7. откры,добавлено Открыто 7. открыаргинина аргинина тия Добавленоаргинина Открытоаргинина тия 0,36 0,349 0,660 96,9 0,36 0,34 94,4 0,6 100 ф о р м у л а изобретения Способ определения аргинина путемобработки раствора анапизируемойпробы цветореагентом с последующим Составитель Л.Русанова Редактор В,Данко Техред Л,Олийнык Корректор Г.Решетн кЗаказ 2599/42 Тираж 847 Подписное В 1 ИНП 111 Государственного комитета СССР го делам изобретений и открытий 11 1111, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Прои зв д тай ля - цо.ц рафическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проек гная, 4 Результаты исследований свидетельствуют, что предложенный способ открывает аргинин в лекарственной смеси "Альвезин" в количествах, совпадающих с указанными в рецептуре, процент открытия добавленного аргинина находится в пределах 94,4-003.Таким образом, предложенный способ является более простым и специфичным, чем известный. фотометрированием полученного окрашенного раствора, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности определения и уп" 20 рощения способа, анализируемый раствор предварительно нейтрализуют дорН 6,9-7,1, добавляют хлороформ,в качестве цветореагента используют раствор бромтимолового синего 25 с рН 4,0-4,6, смесь перемешивают достабильности окраски, после расслоения фаз отделяют хлороформный слой,обрабатывают часть его 0,1 М раствором гидроксида натрия и после рас слоения смеси фотометрированию подвергают водный слой.