Способ получения 7-бром-5-(о-, м-, п-хлор)фенил-3-метил-1, 2 дигидро-3н-1, 4-бенздиазепин-2-онов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 09) (1 594 С 2 Р Й КОМИТЕТ СССРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ГОСУДАРСТВЕНН ПО ДЕЛАМ ИЗОБ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ КМ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Физико-химический инститнм. А.В.Богатского и Институтробиологии АН СССР(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения биологически активных веществ. Целью изобретения явля"ется повышение выхода и оптическойчистоты целевого продукта. Способпредусматривает культивирование клеток Яйгерйошусез гозеосЬгощояепезВКМ Ав водной питательной средеи инкубирование при рН 6,5-7,5 втечение 18-24 ч с последующим выделением целевого продукта. 1 табл.1388424 Влияние времени инкубации на выход 7-бром-(о-хлор)фенил-метил,2-дигидро"ЗН,4-бенэдиазепин-она приведено ниже.Время инку- Выход 7-бромбации, ч -(о-хлор)фенил. -З-метил,2-дигидро-ЗН -1,4-бенздиазепин-она,% от максимальИзобретение относится к микробиологической промышленности и касаетсяполучения биологически активных соединений.Цель изобретения - повышение выхода и оптической чистоты целевогопродукта.Способ заключается в том, чтоклетки Бггергощусев говеосЬгошояепеяВКМ Акультивируют в питательнойсреде, содержащей, г/100 мл НО: кукурузный экстракт 1; глюкозу 0,5;(ИН 4) БО 0,35; СаСО 0,5; крахмал1,5; МаС 1. 0,5, при рЙ 6,5-7,5, затемвносят 7-бром-(о-,м-,п-хлор)фенил,3-диметил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиаэепин-он, инкубируют в теочение 18-24 ч при 28-30 С с последующим выделением целевого продуктапутем экстракции хлороформом и перекристаллизацией из спирта,Культура Бггерготпусея говеосЬгошорепея ВКМ Адепонирована воВсесоюзной коллекции микроорганизмов 25ИБФМ АН СССР,Способ позволяет получить оптически активные 7-бром-(о-,м-,п-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенэдиаэепин-оны в качестве единственного продукта с выходом 45-487.или, учитывая образование оптическиактивного продукта, 90-967. ного 37,5 41,7 18 95,8 24 100,0 100,0 100,0 30 36 При времени инкубации 30 и 36 чнаблюдалось образование 3-оксипроизводного,Влияние рН среды инкубации на выход 7-бром-(о-хлор)фенил-метил"1,2-дигидро-ЗН,4-бенэдиаэепин-она приведено ниже:рН среды Выход 7-броминкубации -5-(о-хлор)фе 35 нил-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она,40Ж от максимального 5,0 60 6,0 6,5 100 7,0 100 7,5 100 8,0 92 9,0 55 10,0 Установлена высокая избирательность к реакциям И-деметилирования 1,4-бенздиазепин-онов штамма Бггергопусея гояеасЬгопорепея ВКМ А, так как проверка в плане И- -деметилирования 1,4-бенздиазепин- -онов других штаммов: Бггергочегг- сг 11 дцт сдпатпопецт ВКМ Аи Бггерготпусея чдгЫдя, ВКМ Ане приводит к положительным результатам, выходы деметилированных 1,4-бенздиазепин-онов не превышают 10-127.На примере И-деметилирования 7- -бром-(о-хлор)фенил,3-диметил- -1,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин- -она показано, что наиболее оптимальным временем инкубации является 18- 24 ч, что при инкубации в течение 12 ч продукт И-деметилирования образуется всего лишь с 41,7 Е выходом от максимального, при увеличении времени инкубации наблюдается побочное образование 3-оксипроизводных 1,4- -бенэдиаэепин-онов, что затрудняет выделение целевого продукта. Приведенные данные подтверждающие,что при рН 6,5-7,5, выходы 7-бром1388424-(о-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро- -ЗН,4-бенздиазепин-онов максимальны.Влияние температуры инкубации на выход 7-бром-(о-хлор)фенил-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин- -2-она приведено ниже:Температура Выход 7-бромоинкубации, С -5- (о-хлор) -фенил-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она, 7 отмаксимального Выход 7-бром-(о-хлор)фенил- -метил,2-дигидро-ЗН,4-бенэдиазепин-она максимален при 28-30 С.Состав среды оптимизируют методом математического планирования по плану полного факторного эксперимента ПФЭ. Способ получения 7-бром- (о-,м-,п-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-онов осуществляют следующим образом. 2- недельную культуру Яггергощусея гояеосЬгощо 8 епея ВКМ А, выращенную на агаризованной овсяной среде, переносят в пробирки с 10 мл среды следующего состава, г/100 мл воды: кукурузный экстракт 0,5, крахмал 0,75, (ИНд) ЯО 0,175, МаС 1 0,25; СаСО, 0,25; глюкоза 0,25, инкубируют на встряхивателе 2 сут при 28О30 С и скорости вращения качалки 220 об/мин, Посевной материал переносят в колбы объемом 750 мл со 100 мл среды состава, г/100 мл: кукурузный экстракт 1, глюкоза 0,5, (ИН ) ЯО 0,35, СаСО. 0,5, крахмал 1,5, ИаС 1 0,5, инкубируют еще 2 сут. Затем в колбы вносят -бром-(о-., м-,п-хлор)фенил,3-диметил,2-ди 15 20 25 30 35 40 45 55 гидро-ЗН,4-бенздиазепин-он вдиметилсульфоксиде и после 18-24 чинкубации экстрагируют хлороформом.Получают 7-бром-(о-,м-,п-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-он. Продукты очищают перекристаллизацией иэ спиртаП р и м е р 1, 2-недельную культуру ЯГгерГощусея гояеосЬгощодепеяВКИ А, выращенную на агаризованной овсяной среде, переносят в 20пробирок, содержащих по 10 мл средысостава, г/100 мл: кукурузный экстракт"0,5, МаС 1 0,25; (ИН 4) ЯО О, 175,СаСО 0,25, глюкоза 0,25, крахмал0,75, и инкубируют 2 сут при ЗО Сна встряхивателе со скоростью вращения 220 об/мин. Содержимое пробирокпереносят в 20 колб Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих по 100 млсреды следующего состава, г/100 мл:кукурузный экстракт 1, ИаС 1 0,5;(ЫН 4) ЯОд 0,35, СаСО0,5; глюкоза0,5; крахмал 1,5, и инкубируют втех же условиях еще 2 сут. Затем вкаждую колбу вносят по 3 мг 7-бром-(о-хлор)фенил,3-диметил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она вдиметилсульфоксиде и продолжают инкубаию при 30 С, рН 7,0 в течение24 ч. Содержимое колб экстрагируютхлороформом, растворитель упариваютв вакуумеОстаток очищают перекристаллизацией из спирта, получают27,7 мг 7-бром-(о-хлор)фенил-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она, продукт оптически активен,О р +96Э щ, 230 нме Тепле243-245 С, выход 48%, а если учитывать образование оптически активногопродукта 967.Найдено, 7.: С 52,6; Н 3,1; И 7,6.С 16 НВгС 1 И ОВычислено, 7: С 52,9, Н 3,3, И 7,7.Согласно данным масс-спектровМВ 363.П р и м е р 2, Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1,время инкубации 18 ч,П р и м е р 3. Порядок выполнения операций аналогичен примеру 1.Пример иллюстрирует нецелесообразность выполнения предлагаемого способа при времени инкубации 12 ч.Больше 24 ч инкубацию производить нецелесообразно, так как при этомнаблюдается образование 3-оксипроизво 1 ного.15 5 138842П р и м е р 4. Порядок выполненияопераций аналогичен примеру 1. Только используется 7-бром-(м-хлор)фенил3-диметил2-дигидро-ЗН4 РВ Ф5-бенздиазепин-он, выход 7-бром-(м-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она 467, (если учитывать образование оптическиактивного продукта 927).10Найдено, 7: С 52,5 Н 3,0 ф И 7,4.С, Н, ВгС 1 ХОВычислено, 7.: С 52,9, Н 3,3;И 7,7.Согласно данным масс-спектровМВ 363.П р и м е р 5. Порядок выполненияопераций аналогичен примеру 1, только время инкубации 18 ч.П р и м е р 6, Порядок выполнения 20операций аналогичен примеру 1, только время инкубации 12 ч, Пример иллюстрирует нецелесообразность выполнения данного способа при этом времени инкубации,25Больше 24 ч инкубацию проводитьнецелесообразно, так как при этомнаблюдается образование 3-оксипроизводногоП р и м е р 7, Порядок выполненияопераций аналогичен примеру 1,только используется 7-бром-(и-хлор)фенил,3-диметил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-он, выход 7-бром-(п-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она 457, если 35учитывать образование оптически активного продукта 907.Найдено, 7.: С 526, Н 32; М 75,С, Н, ВгС 1 И 0Вычислено, 7: С 52,9, Н 3,3,И 7,7.Согласно данным масс-спектраМВ 363.П р и м е р 8, Порядок выполненияопераций аналогичен примеру 1, только время инкубации 18 ч.П р и м е р 9. Порядок выполненияопераций аналогичен примеру 1, только время инкубации 12 ч. Пример иллюстрирует нецелесообразность выполнения данного способа при этом времени инкубации,бБольше 24 ч инкубацию производить нецелесообразно, так как при этом наблюдается образование 3-оксипроизводного.Таким образом, предлагаемый способ получения оптически активных 7- -бром-(о-,м-,п-хлор)фенил-З-метил- -1,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин- -онов по сравнению с прототипом позволяет повысить выход 7-бром-(о-, м-,п-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро- -ЗН,4-бенздиазепин-онов с 10- 117. в прототипе до 45-487, получить 7-бром-(о-,м-,п-хлор)фенил-З-метил- -1,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин- -оныв качествеединственного продукта, тогда как в прототипе образуются еще 3- -оксипроизводное 1,4-бенздиазепин- -она, получать оптически активные 7-бром-(о-,м-,п-хлор)фенил-З- -метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-оны, для 7-бром-(о-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН,4-бенз 0 о диазепин-она о+96Результаты М-деметилирование - -бром-(о-,м-,п-хлор)фенил,3-ди-. метил,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-онов по примерам 1-9 приведены в таблице.формула изобретенияСпособ-получения 7-бром-(о-,м-, п-хлор)фенил-З-метил,2-дигидро-ЗН- -1,4-бенздиазепин-онов, предусматривающий культивирование микроорганизма-биотрансформатора в водной питательной среде, содержащей кукурузный экстракт, углевод и факторы роста, инкубирование до максимального накопления целевого продукта в присутствии И-метилпроизводного,2-дигидро-ЗН,4-бенздиазепин-она с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения выхода и оптической чистоты целевого продукта, в качестве биотрансформатора используют штамм актиномицета БГгергошусев говеосЬгошо 8 епев ВКИ А,культивирование ведут в питательной среде, содержащей в качестве углевода - глюкозу в количестве 5 г/л воды, а инку" бирование ведут при рН 6,5-7,5.11388424 Вьйод 7-бром- -(о-,м-,п-хлор) - фенил-метил- -1,2-дигидро-ЗН- -1,4-бенздиазе-г- н , И от максимального Времяинкубации Соединение Пример 100 1 7-Бром- (о-хлор) фенил1,3-диметил,2-дигидро- ЗН,4-бенздиазепин-он 24 95,8 18 41,7 7-Бром-(м-хлор)фенил,3-диметил,2-дигидроЗН,4-бенздиазепин-он 24 18 10093 36 2 7-Бром-(и-хлор)фенил,3-диметил,2-дигидроЗН,4-бенздиазепин-он 24 18 10091 12 Составитель Л,БорисоваТехред А.Кравчук Корректор Н.Король Редактор Н.Киштулинец Тираж 520 ПодписноеВН 1 Я 1 П Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытйй113035, 11 осква, Ж, Раушская йаб., д. 4/5 Заказ 1549/28 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4