Способ получения -молочной кислоты

, .ас 1 о 97 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ С СР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИ(54)(57) СПОСОБ ПО)УЧкНИЯ О-молоЧНой КИСЛОТЫ путем сбраживания глюкозы ил лактозы бактериями рода .ас 1 оЬас 111 ц в присутствии источника азота, регулятора рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при рН 4,5 - 7,0 и температуре 30- 50 С с последующим выпелением целеевого продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода кислоты, из бактерий рода .асоЬас 11 цз используют штамм Ьас 111 цз Ьц 1 цаг 1 сцз 05 И 229.Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именнок способам получения О-молочной кис-,лоты сбраживанием сахаров.Известен способ получения О-молочной кислоты путем сбраживания глюкозы или свеклосахарной мелассы в присутствии питательных минеральныхсолей штаммом 1.асйоЬас 11 цэ е 1 сЬшапи АМСС 4797. Выход за б 0 ч составляет 113 г О-молочной кислоты1 1.Наиболее близким к изобретениюявляется способ получения .О-молочнойкислоты, заключающийся в сбраживанииглюкозы или лактозы молочного сахара бактериями рода .асоЬас 11 цэна питательной среде в присутствииисточника азота, карбоната кальция,регулирующего рН среды, и другихпитательных минеральных солей в 20анаэробных условиях при рН предпочтительно 5,1 и температуре до 50 ОСс последующим выделением 0-молочнойкислоты, Выход кислоты составляетдо /О г 2 25Целью изобретения является повышение выхода О-молочной кислоты.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу полученияО-молочной кислоты, предусматривающему сбраживание глюкозы или лактозыбактериями рода .асйоЬас 11 цз в присутствии источника азота, регулятора рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при З 5рН 4,5-7,0 и 30-50 С с последующимвыделением целевого продукта из бактерий рода .ас 1:оЬас 1 цз используютштамм .асоЬас 111 цэ Ьц 19 агсцэ О 5 М2129. /40Используемые дляполучения О-молочной кислотыштамм .асйоЬас 111 цзЬцдаг 1 сцэ О 5 М 2129 выделен из подкисленной молочной пробы и улучшенпланомерной селекцией таким образом, 45что продуктивность его за 48 ч достигает 115 г/л молочной кислоты.Штамм депонирован в немецкой коллекции микроорганизмов под номером05 М 2129. 50Идентификация штамма показывает,что он состоит из длинных грамположительных палочек, отрицательных ккаталазе, неподвижных, микроаэрофильных. 55Биохимические характеристики,Обмен веществ. Гомоферментативное молочнокислое брожение: газ из глюкозыгаз иэ глюконатарост при 15 Срост при 45 С +Образование кислоты из;рибозыарабинозыксилозыманнитасорбитаглюкозыгалактозылактозымальтозысахарозытрегалозыцеллобиозымелибиозыраффинозысалицинаамигдалинаРасщепление аргининаКонфигурация молочной кислоты:О /-/,Диаминопимелиновая кислота встенке клетки: никакой.Штамм .асйоЬас 11 цз Ьц 19 аг 1 сцэ05 М 2129 не специализирован на брожении глюкозы, а может сбраживать( ферментировать) молочный сахарпочти так же быстро, как и глюкозу,до молочной кислоты. Таким образом,имеющуюся в больших количествах, в .качестве отходов молочной промьпдленности, свежую молочную сыворотку или в виде суспензии порошка молочной сыворотки можно использовать в качестве источника сырья для производства О-молочной кислоты.Используемые,цляполучения О-молочной кислоты питательные среды составляются известным образом. Они наряду с глюкозой и/или молочным сахаром содеркат также источник азота, например мясной экстракт,.кукурузную набухающую в воде муку Согпэцр, или соевую муку. Кроме того, добавляютминеральные соли, витамины и поверхностно-активные средства. В качестве поверхностно-активных средств используют продажные неионные поверхностно- активные вещества, прежде всего жидкие продукты. Эти поверхностно-активные вещества содержат в качестве биологически активного вещества полиоксиалкилаты, например продукты взаимодействия спиртов и кислот С этиленоксидом и/или пропиленоксидом,139375 10 В качестве спиртов используют однои многоатомные спирты. Такие, как жирныеспирты", смоляные спирты, глицерин,зригрит, пентаэритрит; или сахарныеспирты, такие как сорбит, и маннит;в качествекислот прежде всего используют жирные и смоляные кислоты. Бла-гоприятны также неполные сложные эфиры из таких многоатомных спиртов иуказанных кислот, как оксиэтилатыангидросорбит-моноолеата.Так как асйоЬас 11 цз Ьц 1 оагсцзОЬМ 229 чувствителен к кислотам,то образующуюся молочную кислотунужно связывать с помощью гидрооксидов, или карбонатов щелочных илищелочноземельных металлов, в особенности карбонатомкальция.рН-Значение,таким образом, поддерживается в области 4,5-7,0, предпочтительно 6,5- 206,8.Любую питательную среду передпосевом .асйоЬас 1 ца Ьц 9 агсцаОБМ 229 стеарилизуют, чтобы устранить возможные загрязнения за счет 25посторонних организмов. Для этогодостаточно нагреть питательную среду в течение 5 мин при 121 С.Как и для всех молочнокислых бро-:жений (ферментаций),для предлагаемого способа требуются анаэробные усло"вия. Для этого достаточно образующейся благодаря нейтрализации молочной кислоты карбонатом кальция, двуокиси углерода или обогащения ферментационной среды азотом./Молочнокислое брожение осуществляют"в температурном интервале 30-50 СоОсобенно благоприятный температурныйинтервал 40-45 С.40Из осаждающейся по предлагаемомуспособу соли О-молочной кислоты можно получить свободную О-молочнуюкислоту с помощью ионообменника илив случае лактата кальция путем подкисления серной кислотой.П р и м е р 1. Рост штаммаасйоЬас 11 цз Ьц 19 агсца 05 М 2129,Находящийся в пробе сброженногомолока штамм .асйоЬас 1 цз Ьц 19 аг 1 сцз выделяют и культивируют в следующей среде 1, г/л:Казеиповый пелтон(Ме гс)с) ОДрожжевой экстракт 5 4Глюкоза 20К НЩ2Ацетат натрияМ 9504.7 НО 0,2Мп 50 .НО 0,05Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/лЗатем пробы штамма разбавляют и производят посев на агаровые пластин- ки, которые приготовлены из той же среды с добавкой 1,82 агара. Инокулированные агаровые пластинки затем в течение дня выдерживают при 45 С в анаэробных условиях в термостате. В целом затем извлекают 30 отдельных колоний и, смотря по обстоятельствай, вносят в пробирку, которая содержит следующую среду 4, г/л:Глюкоза 50СаСО 70Дрожжевой экстракт 7Кукурузная набухающая мука (сухая) 15Ацетат натрия 5Неионное поверхностноактивное вещество .1 мл/лВремя культивирования составляет 24 ч при 45 С. Спустя 24 ч отчетливо виднаразница между различнымй хорошо сброженнымикультурами и обра зовавшимися количествами О-молочнойкислоты, Пробирку с самым большим количеством О-молочной кислотыисполь зуют для нового мазка на стекле. Этот процесс повторяют регулярно в течение 8 нед., и при,этом содержание сахара в среде повышают сначала до 8 Е и спустя следующие 5 нед. до 103, Затем штамм селекциочируют следующие 12 нед. до тех пор, пока он не станет способен метаболизировать 100 г глюкозы/л среды в течение 24 ч на 553, причем образуется 55 г 0-молочной кислоты/л. Полное разрушение глю" .козы наблюдается спустя 36-40 ч.П р и и е р 2. Полученный согласно примеру1 штамм .асйоЬас 1 цз Ьц 19 агецио помещают в пробирки, которые содержат по 15 мл среды. Пробирки для культуры ставят вертикально при 45 С по меньшей иере на 8 ч и. самое ,Рольшее на 20 ч и затем используют в качестве инокулята для культур в колбах Эрленмейера, которые содержат по 250 мл среды 1. Их также выдерживают при 45 С 8-20 ч. Содержимое 6 указанных колб Эрленмейера затем служит в качестве инокулята для ферментаемкостью 30 л, в который предварительно помещена следующая среда 2, г/л;Глюкоза 30С Ы,15Дрожжевой экстракт5Казеиновый пептон 10Кукурузная набухающаямука сухая) 20Лцетат натрия 5Неионное поверхностно 10активное вешество 1 мл/лферментеры перемешивают со ско-ростью 100 об/мин, и спустя 8-12 ч при 45 С в ферментер загружают содержимое в количестве 270 л, которое содержит либо указанную в примере среду, либо следующую среду 3, г/л:Глюкоза 30СаСОэ 70Дрожжевой экстракт 7 20Соевая мука 15Ацетат натрия 5Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/лПосле выращивания культуры, т,е. 25 спустя 7 ч, добавляют еще глюкозу. При добавлении глюкозы руководствуются потреблением глюкозы и образованием кислоты. В целом в течение примерно 45 ч добавляют такое количество ЗО глюкозы, которое составляет примерно 10 вес,% питательной среды. Из глюкозы образуется 115 г 0-молочноц кислоты питательной среды ( равно 1 бб г лактата кальция). Выделение свободной молочной кислоты осуществляют известными способами, а именно осаждением кальция серной кислоты, фильтрацией, выпариванием и очисткой, путем перегонки в виде сложного этилового или метилового эфира.Применение среды 3 имеет то преимущество, что в целевом продукте ле содержится обнаруживаемого количества 1.-молочной кислоты. Среда 4 имеет 15 преимущество в том, что она после ферментации лучше фильтруется, чем среда 3, так как соевая мука в среде 3 разрушается только частично. Иолу . ченный с помощью среды 4 продукт 50 содержит 2% 1.-молочной кислоты, которая происходит из кукурузной набухающейся муки в среде.После Фильтрации возможно расщепление доли 1.-молочной кислоты путем 55 пропускания фильтрата через ферментивный реактор, который содержит фермент, расщепляющий специфически 1.-молочную кислоту. Пригодны системы с 1.-лактатоксидазой, 1 -лактатдегидрогеназой или цитохромом Ь 2, Лактатдегидрогеназа нуждается в качестве кофактора в Мй 0, который также может быть связан с носителеми затем может. регенерироваться и применяться вновь. Дпя цитохрома 6 пригоден в качестве кофактора гексацианоферрат, который может снова повторно окисляться с помощью электри- ческого тока на электроде из благородного металла.П р и м е р 3. Согласно указанному в примере 2 способу готовят штамм- культуру и инокулят, однако в качестве питательной среды применяют следующую среду 5, которая содержит молочный сахар в качестве сбраживаемого субстрата, г/л:Порошок молочнойсыворотки 60Сасо 70Дрохскевой экстракт 3Соевая мука 5Лцетат натрия 5Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/лКак и в примере 2, после выращивания культуры добавляют дополнительно сахарный субстрат, а именно до тех пор, пока добавленное в целом количество молочного сахара не составит 30 г/л. Образование молочной кислоты длится ческолько дольше, чем в примере 2, однако спустя 50 ч заканчивается. В остальном поступают описанным в примере 2 образом. Выход 0-молочной кислоты составляет 100 г/л,П р и м е р 4. 1 цтаммовая культура и инокулят готовятся при насыщЕении азотом, как в примере 1, Используют среды 3,4 или 5, однако они сначала не содержат СаСО .Его в сухом виде или в виде 207,-ной суспензии добавляют потом, так, чтобы рН не снижалось ниже 5,5. Спустя 48 ч начинают дополнительное дозиоование питательного раствора. Ско- l рость разбавления составляет 0,01 л/ч на литр питательного раствора, причем равные количества жидкости непрерывно извлекают из ферментера. Скорость разбавлениямедленно увеличивают до величины 0,04 л/ч на литр питательного раствора, причем слив из ферментера имеет содержание 0-мо375 Составитель Н;Приваловаредактор В.Данко ТехредС.Мигунова Корректор А.Ильин Заказ 10711/46 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035,Москва,Ж,Раушская анбд.4/5 Филиал ППП "Патент",г.ужгород,ул,Проектная,4 7 1139 лочной кислоты 5-73. Клеточную массу непрерывно отделяют от слива с помощью непрерывно функционирующего сепаратора и на 907. возвращают в ферментер. В выделенной части уста навливают рн 6,5 с помощью гидрокси-, да кальцияи упаривают до 1/10 ее первоначального объема, Б низкотемпера- турной ловушке концентрат охлаждают до 4 ОС, при этом выкристаллизовывается лактат кальция. Концейтрированный раствор непрерывно подают в низкотемпературную ловушку, в то время как осадившийся лактат кальция выводят в регулярные интервалы с помощью ши бера. маточный раствор возвращают в ферментер. Выделение молочной кислоты из полученного лактатз кальция осуществляется с помощью серной кислоты и путем последующей фильтрации. 20 Выход составляет 1 О г 0-молочной кислоты на литр питательной среды.П р й м е р 5, 11 овторяют непрерывное получение молочной кислоты,что для регулирования рН испопьзуютне СаСО , а гидроксид натрия. Преимущество этого способа заключается втом, что он позволяет поддерживатьрН при 6,5-Ь,8, благодаря чему скорость брожения .асоЬас 1 оз ьц 1 аагсвз ОЪМ 2)29.повышается. Образовавшийся раствор лактата натрия пропускают через ионообменные колонки,которые абсорбируют молочную кислоту.Как только колонка будет загруженамолочной кислотой, последнюю элюируют соляной кислотой. После регенерации разбавленным раствором гидрокси,да натрия колонку снова можно использовать для адсорбции молочной:кислоты. выход О"молочной кислоты 115 гна литр питательной среды. Использование предлагаемого способа обеспечивает более высокийвыход целевого продукта и получение его оптически чистым.