Способ получения -маннаназы

(088,8) бли Да ания описания 15,09.82 И. Н, Павлова, И. Я. 3 и Н, 3. Тиньянова72) Авторь изобретен дена Трудового Красного Знамени институт микробйологии-.-,:,. и вирусологии им, Д, К. Заболотного 71) Заявител(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ а - МАННАНАЗЬ Дрожжевой маннанАммоний сернокислыйМагний сернокислыйЖелезо сернокислое закКальций хлористый,0 1Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству фер. ментных препаратов, и касается фермента а . маннаназы, которая может быть использована в научно-исследовательских биохимических и5 химических лабораториях в качестве аналитического препарата при установлении структуры маннанов, а также для .гидролиза маннанов и маннозосодержащих биополимеров при различных технологических процессах, когда их присутст. вне нежелательно, в частности при получении биологически активных веществ их дрожжей, при гидролизе высокополимерных углеводсодер-. жащих веществ в винах и пр. 15Известен способ получения фермента, ра щепляющего дрожжевой маннан, с помощью культуры АгФгоЬастег 6-Мхранящейся вколлекции живых культур лаборатории биохи мии Калифорнийского университета (Беркли, 20 США), питательной среде, содержащей источник углерода, азота, минеральныесоли и воду, в ус- ловиях аэрации. Продуцент синтезирует внеклеточную маннаназу на среде состава, в г/л: Дрожжевой экстракт 0,5Калий фосфорнокислыйдвузамеше нный 7,54Калий фосфорнокислыйоднозамеще нный 2,32Вода До 1 л и 111Ферментация проводится при 30 С на качалке в течение 36 ч, Маннаназная активность куль. туральной жидкости составляет 5 - 6 ед/мл.Недостатком этого способа является применение в качестве продуцента и - маннаназы не. доступного для использования в нашей стране штамма микроорганизма из рода АгтпгоЬастег.Цель изобретения - повышение активности целевого продукта и его удешевление,Поставленная цель достигается тем, что со. гласно способу получения а - маннаназы путем культивирования микроорганизма продуцента3 958498на питательной среде, содержащей источникуглерода, азота, минерзльные соли и воду, вусловиях аэрации, в качестве продуцента используют штамм йосагйа егутЬгоро 1 е ИМВ - 19,а в качестве источника углерода - клетки пе.карских дрожжей в количестве 10 - 20 г/л.Штамм ИМВ - 19 выделен иэ лесной почвы врайоне г, Киева. Хранится в центральном музеепромышленных микроорганизмов, "ВНИИГенетика" под номером ЦМПМ 8 - 555. Штамм имеет 1 рследующую характеристику,Морфологические признаки, Культура й,егутЬгоро 1 з ИМВ - 19 не образует воздушногомнцелня. При росте на органических средахклетки 14 - 16 - часовой культуры представляют 15собой длинные тонкие прямые или слегка искривленные палопси, иногда разветвленные. К24 часам роста клетки становятся палочкамисредних размеров (6 - 8 мк х 0,6 - 1,0) появ.ляются кокки. К 36 часам роста наблюдается 20преобладание кокковидных клеток. Клеткиве имеют капсул и зндоспор, неподвижные,грамположительные, слабо кислотоустойчивые,На агаризованных органических средах росткультуры й.егуФгоро 11 з ИМВ - 19 обильный, 25колонии гладкие, блестящие, пастообрзвные,бледнорозовые, При росте в МПБ культураобразует муть и обильный осадок.Культурзльные и биохимические свойства,Штамм й.егуФгоро 11 з ИМВ - 19 растет при10 - 40 С (оптимальная температура 28 ОС призначениях рН среды 6,0 - 10,0 в аэробнь 1 хусловиях. Предлагаемый в качестве продуцентаа - маннаназы микроорганизм способен растина средах с 5йаС 1, но не растет при 7% этойсоли в среде.В гидролиэатах клеток этого штамма обнаружены в больших количествах арабиноза,галзктоэз и глюкоза, а также мезодиаминопимелиновая кислота и характерный для нокардий липид1.Сй - А.Культура й.егуФгоро 1 з ИМВ - 19 сбраживает с образованием кислоты глюкозу, сахарозу,ксилозу, маннозу, рамнозу, фруктоэу, глицерин,маннит, сорбит и не сбраживает арабиноэу,45гзлактозу, лактозу, мальтозу, раффиноэу, сорбо.эу, сзлицин, дульцит и метил-О-глюкозид,Штамм й.егуФгоро 11 з ИМВ - 19 способен испольэовать в качестве единственного источникауглерода натриевые соли лимонной, молочной,пировиноградной, уксусной, янтарной и бензойной кислот, а также дрожжевые а -маннаны.Найтрий виннокислый и щзвелевокислыйкультурой не утилизируются. Микроорганизмрастет на средах с аммонийиыми солями вкачестве источника азота,55Штамм не пептонизирует молоко, не разжижает желатину, не гидролизует крахмал, нитратывосстанавливает до нитритов слабо, образует0,03 - 0,05 Замена в среде дорогостоящего и труднонарабатываемого в лабораторных условияхманнана клетками пекарских дрожжей и устранение из нее дрожжевого экстрзкта делаетсреду экономически более выгодной и болеедоступной для изготовления,Предлагаемый. способ получения а-маннаназы.состоит из двух стздий,Стадия 1. Выращивание инокулюма.Питательную среду засевают маточной культурой й.егуФгоро 11 з ИМВ - 19, выращенной наплотной среде состава, г/л воды:Клетки пекарских дрожжей , 3,0Аммоний сернокислый 0,5Магний сернокислый 0,2Кальций хлористый 0,05Железо сернокислоеэак ясноеКалий фосфорнокислыйдвуэамеще нный 7,54Калии фосфорнокислыи однозамещенный 2,32Дрожжевой экстракт . 0,5Агар - агар 15-20Выращивание инокулюма проводят в жид.кой среде, состава, г/л воды:Клетки пекарских дрожжейАммоний сернокислыйМагний сернокислыйКальций хлористыйдвухводный 0,05Калий фосфорнокислыйдвузамеще нный 7,54 0,01 10,0 0,5 0,2 фтирозиназу, каталазу, р-нитрофенолоксидаэу. На известной полусинтетической среде при глубинном выращивании синтезирует внеклеточную амайнаназу . Активность к 36 часам выращивания составляет 10 - 17 ед/мл кулътурзльной жидкости.Сущность способа состоит в том, что ппамм й.егуЮгоро 1 з ИМВ - 19 вырзщивают на среде, отличающейся от описанной выше и использо-. вавшейся для выращивания продуцента а-ман. наназы из рода АгтЬгоЬастег, а именно на среде, содержащей вместо дрожжевого маннана в качестве источника углерода клетки пекарских дрожжей и имеющеи состав, г/л:Клетки пекарских дрожжей 10-20Аммоний сернокислый 0,2 - 0,5Магний сернокислый, 0,2Кальций хлористь 1 йдвухводныйКалий фосфорнокислыйдвузамещенный 7,54Калий фосфорнокнслый одноэзмещеннйй, 2,32Вода водопроводная До 1 лрн 70 73958498 0,05 10,0 0,2 0,2 7,54 5Калий фосфорнокисддьдйоднозамещенный гзгрН 7,0 - 7,2Выращивание проводят в 0,5 - литровых кол. бах со 100 мл среды на качалке с 220 - 240 об/мин в течение 24 - 30 ч при 27 - 29 С.Стадия 2, Биосинтез а.маннаназы.В 0,5 - литровые колбы, содержащие 100 - 125 мл аналогичной среды с дрожжевыми клет. ками (состав ее приведен выше), вносят 5% к объему среды инокулюма, Ферментацию ведут на качалке с 220 - 240 об/мин при 27 - 29 С в течение 36 - 40 ч. Активность культуральиой жидкости к этому времени составляет 10 -17 ед/мл, в течение 5-7 ч оиа остается ста , бильной, затем начинает медленно снижаться.Активность а-маннаназьд определяют понарастанию количества редуцирующего сахара (маннозы) в инкубационной смеси, содержа.щей исследуемый материал (культуральную 20 жидкость), субсдрат (маннаи пекарских (дрож. жей) и соответствующий дуфер. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обуславливает образование1 мкмоля маннозы при гидролизе маннанав условиях опыта за 1 ч,Количество редуцирующего сахара (маннозу)определяют по методу Нельсона - Сомоги.Фермент из культуральной жидкости вьщеляют известным способом. Полученный с помо.щью й.егут 1 дгоро 1 да ИМВ - 19 препарат а.маннаназы катализирует гидролиэ а-манапов посвязям 1,2 и 1,3 с опцеплекием маннозы.. Использование предлагаемого способа может быть проиллюстрировано следующимипримерами,П р и м е р 1. Выращивание инокулюмаштамма И.егуФгоро 1 да ИМВ - 19 и ферментацию проводят на среде, предложенной для син.теза маннаназы микроорганизмом иэ родаАгтддгоЬастег в 0,5-литровых колбах, содержа.щих по 100 мл среды, на качалке с 240 об/мин,Колбы для выращивания инокулюма засевают2- суточной культурой Й.егу 11 дгоро 1 е ИМВ - 19выращенной на агариэованной среде того жесостава, и инкубируют их 24 ч при 28 ОС.Затем посевной материал (инокулюм) в количестве 5 о к объему среды вносят в ферментационные колбы и ведут инкубацию 36 ч при той же50температуре, К концу ферментации активность .культуральной жидкости составляет 2,6 ед/мл, Выделение а-маннаназы из культуральной жидкостиосуществляют известным сподхдбом,П р и. м е р2, Вырыцивание инокулюмапроводят на той же среде и в тех же услови.55ях, что и в примере 1,Ферментацию проводят на среде состава,г/л воды: 6Сухие клетки пекарскихдрожжей 10,0Аммоний сер нокислый 0,5Магний сернокислый 0,2Кальций хлористыйдвухводныйКалий фосфорнокислый двуэамещенный 7,54Калий фосфорнокислыйодно замешенный 2,32рн 7,0Выращивание культуры проводят в уело.виях примера 1, .Активность культуральнойжидкости к концу ферментации составляет13,7 ед/мл, т. е, в 5 раз выше, чем при выращивании продуцента на среде с маннаном(пример 1).П р и м е р 3, Выращивание инокулюмаи ферментацию проводят в условиях, приведен.ных в примере 1, на среде, содержащей клетки пекарских дрожжей (состав среды приведенв примере 2), Активность культуральной жидкости к концу ферментации составляет 7 ед/мл.П р и м е р 4, Выращивание инокулюмаи ферментацию проводят в условиях примера 1на среде состава, г/л воды:Клетки пекарских дрожжейАммоний сернокислыйМагний сернокддсльдйКальций хлористыйдвухводный 0,03Калий фосфорнокислыйдву замещенныйКалий фосфорнокислыйоднозамещенный 2,32Активность культуральной жидкости к кон.цу ферментации (40 ч) составляет 10,6 ед/мл.П р и м е р 5, Выращивание инокулюмапроводят на среде, приведенной в примере 2,в условиях примера 1.Ферментацию проводят в условиях примера1 на среде состава, г/л воды:Клетки пекарских дрожжей 20,0Аммоний сернокислый 0,2Магний сернокислый 0,2Кальций хлористый 0,03Калий фосфорнокислыйдвузамещенньй 7,54Калий фосфорнокнслыйодноэамешенный 2,32Активностькультуральной, жидкости й,егутЬгоро 1 да ИМВ - 19 к концу ферментации составляет 17,2 ед/мл.Сравнительная характеристика а -маннаназ. ной активности штамма й.егудпгоро 1 дв ИМВ - 19 на различных средах приведена в таблице,Таким образом, предлагаемый штамм й,егуОзгоро 1 да ИМВ - 19 при выращивании на рекомендованной среде с дрожжевыми клетками7 958498 8проявляет более высокую (в 2 - 3 раза) а-маи. по сравнеюпот известным в литературе пронаназную активность при удешевлении среды, центом этого фермента АгтЬгоЬастег 6-1 Ч - 1. Среда для ферментации Пример Ифс маннаном с маннаном с маниаком с дрожжевымиклетками, 10 г/л 13,7 с дрожжевымиклетками, 10 г/л с дрожжевымиклетками, 10 г/л 17,0 10,6 с дрожжевымиклетками, 20 г/л 17,2 Формула иэобрете ния Составитель И, Привалова Техред Т, ФантаКорректор Г. Огар Редактор М, Келемеш Заказ 6983/37,Подписное Тираж 505 ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретешсй и открытий 113035, Москва, Ж 35, Раушская наб д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проекпсая, 4 Способ получения а-маннанаэы путем культивирования микроорганизма продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода, 2 азота, минеральные соли и воду, в условиях аэрации, о т л и ч а ю щ и Й с я тем, что, с целью повьпдения активности целевого про,- дукта и его удешевления, в качестве продуцента используют штамм йосагс 11 а егутЬгоро 1 са ИМВ - 9, а в качестве источника углерода - клетки пека 1 эских дрожжей в количестве 10 - 20 г/л.Источника информации,принятые во внимание при экспертизе1. допев 6. Н., Ва 11 оп С. Е. 1 ао 1 атсоп о 1 ап а.ваппоайаае ссссЬ 1 сЬ ссдго 1 сзес уеаат вап - пап. Зтгцстцгв оФ тЬе Ьасйюссе оФ уеаат ваппап. - ,1. В 1 о 1. СЬев. 1968, 243, 9, р. 2442 - 2446.