Способ определения гаптена в антигене

(я)М, (л,3 А 61 В 10/00//6 01 й 33/54 с присоединением заявки М 2 Государственный комнтет СССР по деяам нзобретеннй н открытий(54) СПОСС)Б ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНА В АНТИГЕНЕ Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть ис" пользовано для определения вакцинных препаратов из антигенных комплексов энтеробактерий. 5Известен способ определения гапте на в антигене методом электрофореза в агаре )11.Однако известный способ не позволяет определить точное количество 10 гаптена в антигене.Целью изобретения является количественное определение гаптена на уровне отдельных рецепторов.Эта цель достигается тем, что 15 эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемым антигеном и референс-гаптеном," затем определяют их специфическуюактивность в реакции массивной гемаглютинацйи и по разности гоказателей специфической активности определяют количественное со-. держание гаптена в антигене.Крометого, сенсибилизирующая до,за исследуемого антигена в 10-20 раз 25 превышает сенснбилизирующую дозу референс-гаптена.П р и м е р. Свежие или формалинизированные эритроциты отмывают физиологическим раствором рН 7,2 30(раствор В 2) центрифугированием при 5-10 С со скоростью 2800-3000 об/мин. Осадок ресуспендируют до 2,5 концентрации Фосфатным буфером рН,4 с содержанием 0,85 хлорида натрия (раствор Р 1) и разливают в стерильные Флаконы по 10-.25 мл. На каждый исследуемый препарат и контрольный гаптен берут по 3 флакона и в четвертый Флакон заливают контрольные эритроциты. В первые 1-3 флакона добавляют разведенный раствором Р 1 исследуемый антиген.Сенсибилнзирующие дозы антигена равняются 50-100 мкг антигена на 1 мл 2,5% эритроцитов. Параллельно Ы другие 1-3 флакона добавляют референс-контрольный гаптен. Ультразвуковой 0-антиген обрабатывают 0,02 М МаОВ при температуре 100 ф С 2 ч, Полученный гаптен диализуют и лиофилизируютеИммунизация кроликов ультразвуковым 0-антигеном вызывала нарастание титров антител до 1:25000-1:50000. После обработки 0-антигена МаОН титры сывороток были равны или меньше 1:160-1;320. Сенсибилизирующая доза гептена в 10-20 раз меньше исследуемого антигена и равняется 5 мкг гаптена на 1 мм 2,5 зритроцитов, Кроме того, готовят контрольные зритроцить, т.е. в один флакон добавляют физиологический раствор в том жеобъеме, что и разведенный антиген игаптен.Для сенсибилизации зритроцитоввсе флаконы ставят в термостат или - в водяную баню при 37 С на 2 ч. Заэто время содержимое всех флаконов.перемешивают 3-4 раза. По истеченйи времени сенсибилизации процесс пре-, кращают добавлением 0,4 формальдегида рН 6,4 (конечная концентрация).Формальдегид добавляют в виде 4 раствора, разведенного раствором Р 1.Содержимое флаконов осторожно переме шивают до и после добавления Формалинаи оставляют при комнатной температуре 60 мин.Содержимое флаконов разливают в центрифужные пробирки, уравновешивают и центрифугируют" в те чение 10 мин при 2,8-3 тыс, об/мин при +5 +10 С. Полученный осадок дваж.ды отмывают раствором Р 2, а затем ресуспендируют до 2,5 концентрации 1/15 М фосфатным буферным раствором рН 7,2 с 0,85 хлорида натрия и 0,4 формальдегида. Полученные диаг ностикумы и контрольные эритроциты исследуют в РАНГА с использованием агглютинирующих адсорбированных монорецепторных О-сывороток.РПГА ставят на олистероловыхпластинках или используют бактериологические пробирки с круглым дном. В ряды лунок или пробирок разливают по 0,4 мг раствора 9 2 (по 12 лунок или пробирок) . В первую лунку или пробирку добавляют разведенную в 2,5 раза сыво ротку, тщательно перемешивают и переносят во вторую лунку или пробирку 0,4 мл и т.д , титруют 10 луйок илИ пробирок. Из последних лунок или пробирок 0,4 мл выливают. Титруют 3 раза. В первый ряд вносят диагностикум, приготовленный нэ гаптейа, во второй - диагностикум, приготовленный из исследуемого антигена, в тре-. тий добавляют контрольные несенси билизированные эритроциты. Диагнбстикумыдобавляют в количестве 0,05- 0,07 мл в каждую лунку или пробирку.Пластины или пробирки встряхива-. ют и оставляют при комнатной температуре на 3 ч или до следующего дня на 1-20 ч, после чего производят учет реакции.Реакцию учитывают по следующей схеме:(+) - положительная (эритроциты равномерно устилают всю поверхность дна лунки или пробирки);(-) - отрицательная (на дне пробирки или лунки плотная "пуговка 1или "колечко" правильной формы);(+) - переходная (эритроциты распределяются по дну лунки, пробирки более концентрированно, по краю появляется плотный ободОк).Число рядов зависит от количества исследуемых антигенов и монорецепторных сывороток.Количество гаптенов в исследуемом препарате определяют путем приравнивания специфической активностидиагностикумов, приготовленных иэисследуемого антигена и контрольногопрепарата с известным количествомгаптена. Если специфическая актив-ность диагностикумов, приготовленныхиз исследуемого антигена и референсгаптена при сенсибилизирующих дозахс десятикратным различием, одинако - 15 вы, то содержание гаптена в исследуемом антигене будет равняться 10,с 20-кратным различием - 5 и т.д.Например, если специфическая активность контрольного препарата при20 сенсибнлизируЮщей дозе 5 мкг равняется 1;40, а специфическая активность опытного препарата,при сенсиби.лиэирующей дозе 50 мкг также равняется 1:40, то из этого следует, что25 исследуе й антиген содержит 10 гатена. При этом используемая монорецепторная сыворотка не должна реагировать с контрольнымИ несенсибилизированными эритроцитами (результатыисследования антигенов, полученныхЗ) из различных энтеробактерий разнымиспособами, представлены в табл, 1и 2).Иэ табл. 1 видно, что брюшнотифоэная вакцина серии 59, полученная методом триптического перевариванияпри сЕнсибилизирующей дозе 50 мкг,дает чувствительность. к рецептору0-9 в разведении 1:40 и к рецептору0-12-1".20. При этом референс-гаптен40 при сенсибилиэирующей дозе 5 мкг крецептору 0-9 обладает чувствительностью в разведении 1:40, а к рецептору 0-12 также в разведении 1:40.Из этого следует,чтовданной серии4 айтйгена (вакцины) содержатся 10гаптена к рецептору 0-9 и 5 к рецептору 0-12. Это означает, что общее содержание гдптена в исследуемомантигене по двум исследуемым рецепторам (0-9 и 0-12) равняется 15.При.исследовании аналогичного антигенабыло установлено, что антиген серии38 содержит 5 гаптена к рецептору0-9 и 2,5 гаптена .к рецептору 0-12.Так как эти исследования проводилисьпараллельно в аналогичных условиях(с использованием одной серии контрольного гаптена, формалинизированных эрнтроцитов, монорецепторных сывороток и т.д.), можно сравниватьбО количество содержания 0-антигенов и0-гаптенов в препаратах производства различных предприятий. Хотя исследуемые брюшнотифозные антигеныбыли приготовлены по одной техноло 65 гии (методбм триптического перевариОбратные титры сывороток в РПГА;и рецепторам Сенсибилизирующая доза препарата на 1 мл 2,5 эритроци- тов Серия брюшнотифоэных0-антигенов 40 40 100 100 10 20 40 50 50 2,5 20 2,5 10 10 40 50 20 50 100 1,25 40 10 40 80 100 20 10 40 50,Нет Нет1 100 Нет Нет 100 Нет Нет Нет Нет вания) разными предприятиями с помощью предлагаемого метода, в короткий срок возможно установление качественных и количественных различий между ними на уровне отдельных рецепторов О-антигена. Так, было установлено, что содержание гаптенов в 0-антигене производства Ташкентского НИИВС в два раза меньше, чем в аналогичном антигене производства Ленинградского НИИВС (7,5 и 15 соответствеино). Таким образом, возможно и установление количественного со. держания 0-антигенов в исследуемом препарате (вакцине) простым вычислением: в препарате производства Ленинградского НИИВС содержится 15 гаптенов (по рецепторам 0-9 и 0-12), а на долю антигена приходится 85, в препарате Ташкентского НИИВС 7,5 и 92,5 соответственно. Аналогичные качественные и количественные различия были получены при исследовании других серий О-антигенов, которые представлены в табл. 1.В брюшнотифоэных антигенах, выделенных методом прогревания бактериальных суспенэий при 56-57 фС в течение 1 ч (гретая вакцина), обнаружено содержание гаптена к, рецептору 0-9 10, к 0-12 5. При исследованииИсследование гаптенов в б Контроль 0-гап. тен серия 11 0-антиген ЛенНЙИВС серия 59 0-антиген ТашНИИВС серия 380-антиген ТашНИИВС серия 38 (а) 0-антиген ЛенНИИВС се-рия 36 0-антиген ЛенНИИВС серия 36 (а) 0-антиген ЛенНИИВС серия 52 (а)0-антиген( гретая вак- цинаМНИИВС серия 1 0-антиген (Фаголиэат)ТбилНИИВС серия 3 Ультразвуковой 0-антиген неактивизированный серия 2 О-антигенов, полученных с помощьюдезинтеграции бактерий Фагон (Фаголизат) и ультразвукового брюшнотифозного О-антигена, гаптены в них не обнаруживаются.Исследование антигенов, полученных из других сальмонеллезных бактерий (сальмонелла мышиного тифа) с по,- мощью гидрбхсиламина при 57 фС в течение 72 ч показали, что в этих препаратах также содержится гаптен (см.табл. 2), Например, к рецептору 0-42,5, а к рецептору 0-12 2,5,Аналогичные исследования О-антигенов мышиного тифа, паратифа А и паратифа В, полученных методом дезин 35 теграции бактерий фагон (Фаголиэат)и ультразвукового 0-антигена из этихже штаммов (см. табл. 2) показали,что в них гаптены не содержатся,Использование предложенного спо 20 соба позволит оценивать качественноеи количественное содержание 0-гаптенов на уровне отдельных рецепторови таким образом сравнивать и отбиратьлучшие методы получения О-антигенов.2 Этот способ создает возможность влабораторных условиях оценивать закороткий срок (несколько часов) нетолько препараты, но и методы их производства.Таблица 1рюшнотифоэных антигенах784872 Наименование препаратаи 9 серии Обратные титры,сывороток вРПГА и рецепторам Сенсибилизирующая доза препарата на 1 мл(контроль) 100 320 320 100 100 160 160 2,5 2,5 160 100 160 2,5 2,5 160 160 С100 2,5 2,5 160 100 320 2,5 Ультразвуковой антигенмышиного тифа серия 2неактивированный Нет Нет Нет 100 Нет 0-антиген Фаголизат мышиного тифа ТбилНИИВСсерия 2 100 Нет Нет Нет Нет 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю. щ и й с я тем, что сенсибилизирующая доза исследуемого антигена в 10 20 раз превышает сенсибилиэирующую дозу референс-гаптена. Формула изобретения 1. Способ определения гаптена в антигене, о т л и ч а ю щ и й с я тем что, с целью количественного определения гаптена на уровне отдельных рецепторов, эритроциты параллельно сенсибилизируют исследуемымантигеном и референс-гаптеном, затем определяют их специфичскую актив ность в реакций пассивной гемагглютйнации и по разности показателей специфической активности определяют"количественное содержание гаптейа в.антигене. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. И)пей К.С. апд ав, "Структура и биологические свойства поверх-. ностных антигенов арамотрицательных бактерий". ). Васйег 1 а 1 о 9 у йечен 1963, 27, 4 р. 352-368. Составитель С. МалютинаРедактор П. ГорьковаТехред Т.Маточка Корректор Л, Иван Заказ 8699/3 Тираж 67.3 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и откритий113035, Москва, Е, Раушская наб., д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Т а б л и ц а 2Исследование гаптенов в антигенах мышиного тифа, полученныхс помощью гидроксиламина при 57 С в течение 72 ч, .