Способ определения мутагенной активности физических факторов

О П ИЗО Свез Советских оциалистически 7018 РЕТЕ слубли АВТОРСКОМУ ЕЛЬ СТВУ 61) Дополнительное к авт(22) Заявлено 24.01,79(21) 2719499/30-15 1) М.Кл.з С 12 К 1 с присоединением заявки -23) Приоритет -Хосударственный комите СССРделам изобретений н открытий 53) УДК 575.247,01.82, Бюллетеньания описания 07.01.8 3) Опубликовано5) Дата опублик 72) Авторыизобретения А, Троицкии и С, Е. Дромашкоетики и цитологии АН Белорусской С(71) Заявител Инсти ПОСОБ ОПРЕДЕЛЕН ГЕННОИ АКТИВНОСТ ИЧЕСКИХ ФАКТОРО(54 фИ Изобретение относится к области методов и принципов оценки мутагенной активности физических факторов среды с помощью микробиологических исследований и может быть использовано для оценки повреждающих генетический аппарат факто 1 ров акнешней среды с целью обнаружения потенциальных генетических опасностей и охраны живых организмов,Как известно основная опасность повышающегося уровня загрязнения окружающей среды заключается в воздействии на генетический аппарат клеток - мутагенном действии.Мутагенное действие физических факторов внешней среды на живые организмы проявляется как в мутациях (имеются в виду точковые мутации) - изменении генетического аппарата клеток путем нарушений в отдельных основаниях ДНК, так и в генетических рекомбинациях - изменениях генетического аппарата путем перемещения отдельных участков ДНК. В свою очередь генетическая рекомбинация сопровождается мутациями вследствие конверсии генов при коррекции молекулярных гетерозигот.Известен способной активности фитем скрещивания ис определения мутагензических факторов пуходных форм бактерий Е. со 11, из которых реципиентная форма обработана физичестоим фактором, а донорская - интактна, выделения рекомбинантных бактерий и определения частоты рекомбинантов по тестируемому гену, по которому судят о мутагенной активности физического фактора 111.Однако этот способ не позволяет выделить и учесть первичные рекомбиногенные повреждения в ДНК вследствие того, что подвергая мутагенному воздействию физическим фактором реципиентные бактерии, в которых при последующем скрещивании их с донорскими бактериями осуществляется процесс рекомбинации, при определении частоты учитывают не только первичные рекомбиногенные повреждения в ДНК, но также и повреждения ДНК, возникающие за счет воздействия на цитоплазму клеток и их ферментные системы. С другой стороны, этот способ не позволяет обнаружить часть повреждений ДНК вследствие нх репарации.Целью изобретения является, раннее выявление мутагенной активности физического фактора путем учета первичных рекомбиногенных повреждений ДНК.Поставленная цель достигается тем, что в способе определения мутагенной активности физических факторов путем скрещи770188 Таблица 1 Частота проксимальных неселективных маркеров (оа) в рекомбинантах Агд+81 г,полученных при облучении донора Н 1 гС нейтронамирго ( еи Воздействия ас пг 55,863,0 53,252,О 49,751,2 52 146 6 45,3 53,0 521 51,7 65,0 55,4 54,0 51,0 Таблица 2 Частоты проксимальных и дистальных маркеров (оо) в рекомбинантах Н 1 э+Тгр + и Рго+Тгр+,.полученных при облучении донора НггС у-лучамиВоздействия ги 5 пг ец агд рго 63,2 50,7 3,1 41,18,6 .27,4 2,6 КонтрольЦоза 5 крадДоза 20 крад 63,6 33,9 54,0 26,7 39,6 ;14,9 0,30,2О 58,1 43,6 вания исходных форм бактерий Е. соИ, одна из которых обработана физическим фактором, выделения рекомбинантных бактерий и определения частоты рекомбинантов по тестируемому гену, по которому судят о мутагенной активности физического фактора, в качестве исходной формы бактерий для обработки физическим фактором используют донорские бактерии Е. соИ, а в качестве интактной - реципиентные бактерии Е, саИ,Предложенный способ позволяет при воздействии физическим фактором и т 1 уо (на клетку) количественно охарактеризовать повреждения ДНК, ведущие к рекомбинации, и учесть переносимые повреждения, не подвергшиеся действию репаращионных систем в донорской клетке,Предлагаемый способ осуществляется следующим образом, В качестве тест объекта для воздействия мутагенным фактором используются штаммы Е, соИ КН 1 гС и АВ 1157 Р - . В качестве примера физического фактора используются у-лучи и нейтроны (могут быть использованы различные физические факторы).Донорские бактерии Е. соИ обрабатывают физическим фактором, после чего скрещивают с интактными реципиентными бактериями Е, соИ, Затем выделяют рекомбинанты, которые методом реплик пересевают на чашки для получения неселективных маркеров по тестируемому гену, и производят подсчет рекомбинантов. Оценку мутагенной активности физического фактора производят на основе математичеКонтроль1-1 ейтроиы 1 МэВ, доза 0,6 крадНейтроны 0,2 МэВ, доза 0,03 крадНейтроны 0,2 МэВ, доза 0,09 крад ской модели рекомбинации, дающей связь между частотами .неселектовных маркеров и параметрами, ха 1 рактеризующими рекомбинацию.П р и м е р. На мембранные фильтры наносят по - 0,5 10 донорских клеток Е. соИ Н 1 гС в логарифмической фазе. Облучение нейтронами производят в дозах 0,6 крад (быстрые нейтроны) и 0,03 и 0,09 крад (про межуточные нейтроны) на горизонтальныхканалах ядерного реактора АН БССР, оборудованных фильтрами для получения нейтронов с соответствующими энергиями. Облучение у-лучами "Ся проводят в дозах 5 15 и 20 крад. Затем на фильтры с облученными клетками наносят по 0,5 10 реципиентных клеток Е. соИ АВ 11571 - и инкубируют на поверхности твердой среды для скрещивания в течение 90 мин при 37 С.Через 48 ч на селактивной среде отбирают рекомбинанты Агд+ 81 г или Н 1 я+ Тгр+, Рго. Тгр+, которые методом реплик пересевают на чашки для получения неселективных маркеров 1 ас+ агв+, рго+ агу+, 1 ец+ агу+, йг+ агд+ или рго+ Ья+, 1 пг+ 1 ец+ Ь 1 я+, агд+ Ья+, ргоч 1 пг+1 еп+, рго+ агд+. Через 12 - 14 ч производят подсчет таких рекомбинантов.В табл. 1 и 2 приведены частоты про ксимальных неселективных маркеров в рекомбинантах Агд+йг+, полученных при облучении донора Н 1 гС нейтронами, и проксимальных и дистальных неселективных ,маркеров в рекомбинантах Н 1 я+ Тгр+ и 35 Рго+ Тгр+, полученных при облучении донора Н 1 гС у-лучами.770188 Оценку активности мутагена проводили на основе математической модели рекомбинации: 1 1 Р 1 г (/г+ тг) Чуг I, - (У -чтг) ,у угтг где Р частота проксимальных неселективных маркеров;частота дистальных неселективных маркеров;вероятность интеграции в рекомбинант начала донорской хромосомы;10 вероятность рекомбинации отцовских генов;вероятность рекомбинации материнских генов;вероятность прерывания реком бинации;тг Параметры рекомбинации в контро Нейтроны 0,2 МэВ Нейтроны 1 МэВ, доза 06 крадПараметры Контроль доза 0,09 крад044+ 0,00210,0038+0,0010 Положительный эффект. личить чувствительность пр мутагенного действия на б 20 примера сравнивают чувствит лагаемого способа и метода таций. По данным Бриджеса и М ность мутирования в расчсте 25 мосому бактерий при обл чами составляет б 10 н б 10-з крад-, и для а-лучеабл. част мосо Позволяет увеи определении актер ии, Для ельность пред- обратных муерояту хро- м-луили ергией нсон на о ученирад й с и 4 облучение вы интеграции на (Р,) и частоты оследнее явление ения в рекомбив контроле фрагмы.позволяет с выопределять реость физических Как следует из т 3 зывает увеличение оть чала донорской хро мь рекомбинации ( ) - п происходит за счет включ нант более коротких, чем ментов отцовской хромосо Предложенный способ сокой чувствительностью комбиногенную эффективн факторов внешней среды.1 - местоположение дистального селективного гена;1 - местоположение проксимальногоселективного гена.Обработку результатов производят на ЭВМ Мирпо программам, разработанным на основе метода наименьших квадратов. При расчетах учитывается, что в контроле параметры тг и ч 7 г равны, а при облучении меняется только коэффициентРезультаты расчета параметров рекомбинации Р, т, а также их приращений О, о, и о, на единицу дозы приведены в табл. 3 и 4.Таблица 3ле и при облучении нейтронами770188 Формула изобретения Техред И, Заболотнова Корректор И. Осиновская Редактор П. Горькова Заказ 28/38 Изд.108 Тирани 504 Подписное НГ 10 Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Тип. Харьк. фил. пред. Патент 3 МэВ 1,12 10 - и рад - или 1;12 Х Х 10 -крад - . Предлагаемый способ показывает чувствительность при облучении у-лучами для вероятности рекомбинации (о,) 3,6 10 -крад -на 1 мин хромосомной карты или - 3,6 10 -крад -для всей хромосомы, т. е. чувствительность предлагаемого метода на 7 порядков выше, чем методаобратных мутаций.Предлагаемый способ особенно чувствителен при определении повреждений ДНК плотноионизирующими излучениями. В данном случае регистрируется каждое попадание часаицы в бактериальную:клетку за исключением сравнительно редких случаев прямого .попадания в оуклеаид. Чувствителыность метода обратных мутаций для плотноионизирующей радиации по данным Бриджвса и Мансона 1 ирайне мала. Вероятность мутации на одну бактериальную хромосому составляет, например, для а-лучей с энергией 3 МэВ 1,12 10 -крад - . Данные по рекомбиногенному действию, измеренные предлагаемым способом, могут быть экстраполированы на эукариотические организмы. Коэффициенты относительной генетической эффективности нейтронов различных энергий, измеренные предлагаемым способом, близки по абсолютной величине к соответствующим значениям для частот хроматидных аберраций в лимфоцитах человека и для хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей.5 Способ определения мутагенной активности физических факторов путем скрещи вания исходных форм бактерий Е. со 11, одна из которых обработана физическим фактором, выделения рекомбинантных бактерий и определения частоты рекомбинантов по тестируемому гену, по которому су дят о мутагенной активности физическогофактора, отличающийся тем, что, с целью раннего выявления мутагенной активности физического фактора путем учета первичных рекомбиногенных повреждений 20 ДНК, в качестве исходной формы бактерийдля обработки физическим фактором используют донорские бактерии Е. со 11, а в качестве интактной - реципиентные бактерии Е. со 11,25 Источник информации, принятый во внимание при экспертизе:1. аоод Т. Н., %а 1 гпз 1 еу К. Н. В 1 орйуз. Я., 1969, 9, 391.