Способ определения активности антибиотика-лактоцида при спиртовом брожении

акалпетентно Союз Советских Социалистических республик(51)М. Кл з С 12 Е 1/00 О 01 й 33/14 с присоединением заявим йо.СССР ио делам изобретений и открытий(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИАНТИБИОТИЮгЛАКТОЦКДА ПРИ СПИРТОВОМВРОЗЕНИИ 1в Изобретен относится к спиртовой проьаааленности, в частности к спосо- бам определения активности лактоцида, используемого в качестве антн-септика при спиртовом брожении.Антибиотик лактоцид является специфическим антисептиком молочнокислых бактерий и применяется в сйирто вой проьвшленности для подавления . 1 р кислотообразукщих бактерий; угнетающих развитие дрожжей и оказывающих . ингибирукщее действие на ферменты.Лактоцид - антибиотик немедицинского ряда, и применение его в спиртовой промьхиленности позволяет сущест венно повысить эфФективность Спиртового .брожения.Известен способ определенйя активности антибиотика-лактоцида,. предусматривающий культивирование молочно- кислых бактерий в присутствии и отсутствии лактоцида, определение степени подавления лактоцидом жизнедеятельности молочнокислых бактерий и расчет активности лактоцида 1 .Недостатком данного способа является то, что применение его дает большой процент ошибки (50-100), кроме того, требуетсм много времени для анализа - 24 час, Метод довольно громоздкий, необходимо большое количество проб, что создает неудобства прй 1 заводсском контроле,Целью изобретения является повышение точности определения и ускорение процесса.Это достигается тем, что в качестве молочнокислых бактерий,исполь зуют ТЬегвооЬассег 1 ие сегеа 1 е абраг штамм ХП, культивирование их осуществляют на солодовой питательной среде в течение 4 час при температуре 52 С, а определение степени подавления лактоцидсм жизнедеятельности бактерий ведут по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида, с последующим расчетом активнос -" ти лактоцида по формуле:766 т 8.4 И ЮАкЛ ед акт/г,агде АкЛ - активность лактоцидаед/гЧ - разница в количестве гидроксида, затраченного натитрование прироста молочной кислоты в контрольнойПитательную среду для размножения посевной бактерии готовят следующим образом: в колбы, наливают 100 мл тако-. го же Фильтрата, добавляют б г стерильного мела и 10 г осадка, полученного при Фильтровании суспенэии. Колбы закрйвают,ватно-маулевЫМи пробками и стерилизуют так же, как описано виае.В качестве тест-организма молоч- . нокислых бактерий используют ТЬегеоЬасСегце сегеа)е .айаг штамм Х из музея штаммов ВНИИПрБ. ТЬегвоЬас"1 ег(ца сегеа 1.е .айаг является предс тавителем группы Вассег це Ое 1 Ьгб" 40 К - термоФильных палочковидных бактерий, длина палочек 2,8-7,0 ммк. Бактерии гомоферментативные, образуют кз сахара только молочную кислоту. Опткьальная температура развития бактерий 48-52 ОС, что является отличительным признаком культуры.Посевную молочнокислую бактерию готовят следующим образом,К 100 мл стерильной питательнойсреды с мелом и осадком добавляют в стерильных условиях 20 .мл,культуры ТпегпГоЬассег(цщ сегеае айаг (штамм Х), затем полученную суспензкю ин-ъ кубифуют в термостате при 48-52 С в те%ение 24 час, размноженную таким образом бактерию выдерживают сутки в холодильнике (4-5 С), а непосредственно перед использованием в опыте или для пересева подогревают в термостате с температурой 48-52 С 40 в течение 1,5-2 час.В.опытные образцы используется жидкая фаза приготовленной культуры бактЕрий, т.е.без осадка и без мела, предварительно разбавленная а - количество лактоцида в титруемой пробе, г 2,766, 3,48 и 10 - постоянные расчетные коэффициенты.Предлагаемый Способ осуществляютследующим образом.Питательную среду готовят следующим образси. К 500 г размолотого яч,Менного солода в возрасте 9-10 дней,добавляют 2 л водопроводной воды,подогретой до 50-55 С. Эту суспенэиюосахаривают в водяном ультратермостате прк температуре 60-65 оС в течение 1 час, затем при температуре65"70 фС еще в течение 1 час. Полученйую суспензию охлаждают до комнатной темйературы, Фильтруют черездва слоя марли и в Фкльтрате содержание сухих веществ доводят до 7с помощью сахариметра добавлениемводопроводной воды. Такой Фильтратразливают по 25 мл в пробирки емкости 50 мп, которые закрывают ватномарлевыми пробками, и стерклйзуютв автоклаве 30 мин при 0,75 атм ииспользуют для опытных проб,стерильной питательной средой такчтобы оптическая плотность разведенного в 10 раз дистиллированной водой образца данной бактерии составляла 0,650 (при определении на фотоэлектрокалориметре, при длине волны365 нм в кювете 6= 1 мм; контрольразбавленная в 10 раэ питательнаясреда). Оптическую плотность используемой культуры бактерии доводятдо этой постоянной величины, выбран. -ной экспериментально для того, чтобы по возможности брать во всех опытах одинаковое количество бактериальных клеток.Приготовление раствора лактоцкда.5 0,01-ный водный раствор исследуемого препарата лактоцида готовят не- .посредственно перед опытом следующим.образом: 0,1-.ный водный раствор препарата лактоцица Кипятят 5 мин на Щ водяной бане, затем 4 раза фильтруют через бумажный складчатый фильтри разбавляют фильтрат в 10 раэ холод"ной дистиллированной водой.Для проведения анализа активнос-ти испытуемого препарата берут несколько пробирок (3-5) со.стерильнойпктательной средой. (без осадка и мела), добавляют в них стерильно оди-.наковое количество водного растворалактоцида и по 2,5 мл подогретой жидкой фазы бактерии с определенной оптической плотностью (0,650 при раэбавлении 1:10) ; Затем пробирки энергич"по встряхивают и культивируют 4 часв термостате при 52 ОС.Одновременно готовят два типа контрольных проб: контроль 1 - для определения количества гидроксида (Ч ),оттитровывающего выносимую с бактерией кислоту, контроль- для определения количества гидроксида (Ч),.оттитровывающего молсчную кислоту,выделенную бактерией за 4 инкубацинее в среде без лактоцида. для этогов такие же пробирки со стерильнойпитательной средой (как й для опытных образцов) заливают 2,5 мл такойже культуры бактерии (что и в опытныеобразцы) и стерильную дистиллированную воду в объеме, равном объемураствора лактоцида, добавленному вопытные пробы, Контроль 1 титруютсразу, контроль- культйвнруют,как и опытные образцы, в термостате4 час при 52 С, а затем титруют вместе с опытными пробами.Для титрования всех проб - к контрольных и опытных - отбирают из каждой пробирки 20 мл, добавляют 34капли универсального индикатора марки "РСКф, титрование проводят 0,025 Яраствором гидроксида натрия (йаОН)до образования светло-эеленой окраски титруемой пробы и рН 7,2.Иэ полученных резу,"ьтатов титрования контроля(Ч) и опытных пробдо образования светло-зеленой окраски пробы и рН 7,2.Получили, что:Ч в .: 2,2 мл (на титрование К 1израсходовано 2,2 мм НаОН),Ч; - 20,2 мл (на титрование К 120,2 мл МаОН),Чо - 14,2 мл (на титрование опытной пробы - 14,2 мл НаОН).Следовательно, Ч = (20,2-2,2)(14,2-2,2) = 6,2 мл.Определим количество лактоцида втитруемой пробе (а). Общий объем реакционной пробы равен 30,5 мл, внем содержится 3 мл 0,01-ного лактоцида, т.е. 0,3 мг, для титрованияберется 20 мл из реакционной пробы.Составим пропорцию: в 30,5 мл содер"жится 0,3 мг лактоцида, а в 20 мл -Х мг.лактоцида; получимго оз0,190 мг.Следовательно а - 0,19010 г,Подставив полученные величины врасчетное уравнение, получим искомую активность данного йрепараталактоцида;(2,7 Ь 6.6 Д,48) 100,1 О 10- ф 74,46 А/гПредлагаемый способ позволяет повысить точность определения (погрешность его 12, а погрешность по известному.способу - 50-100) и ускоритьпроцесс определеййя"с 25 час доб час. Кроме того, он менее трудоемок. Формула изобретенияСпособ определения активности,антибиотика- лактоцяда при спиртовом брожении, прейусматривакЮийкультивирование молочнокислых бактерий в присутствии и отаутствии лактоцида, определение, степени подавления лактоцидом жизнедеятельностимолочнокисмых бактерий и расчетактивности лактоцида, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью позышения точности определения и ускорения процессаь качестве молочнокислых бактерий используют ТЬегаоЬасйегцв сегеа 1 е .айаг штамм Х 11,культивирование их осущес".являютна солодовой питательной среде в течение 4 часов при температуре 52 оС,а определение степени подавлениялактоцидом жизнедеятельности бактерий ведут по количеству продуцируемой бактериями молочной кислоты, титруемой раствором гидроксида, с последующим расчетом активности лактоцида по Формуле,(2 льЬУ-З.48) 10-з61, актг,гдв Ак 1 - актйвность лактоцида, едуг;Ч - разница в количестве гидроксида, затраченного наЪ затраченный на титрование вносимой кислоты, и получают таким образом сведе,ия об объеме раствора гидроксида, затраченного натитрование прироста кислоты за 4 час культивирования с лактоцидом (ЧццдЧо -ЧС) и без лактоцида (ЧМ,акт Ч 1 т - Ч Разница Ч цайт Чкагч= Ч покажет объем раствора гидроксида, затраченный на титрование молгчной кислоты, выделение которой подавляется заданным ко.ичеством лактоцида.0Активность лактоцида рассчитывают по Формуле:(2 Л 66 У-З,48) Оед акт/г,. где У - разница в количестве гидроксида, затраченйого на титрование прироста молочной- кислоты в контрольной (без лактоцида) и опытной (с лакто-цидом) пробах, т,е. Ч = 2 ОЬ 3 ьо - чадит = (чп -У 1 )- (чо У 1 )мла - количество лактоцида в титруемой пробе, г;(2,766 3,48) 1 ОЗ - постоянные коэФ- фициенты, определенные экспериментальным путем.25М ВЗа единицу активности лактоцида принято такое его количество, которое за 4 час,подавляет нарастание 1 г молочной кислоты, образующейся при культивировании молочнокислой бак- терни и штамма Х. Это количество составляет 20 ной кислоты, которая образуется при отсутствии лактоцида в стандартных условиях на солодовой среде.35П р и м е р. Для анализа взят препарат антибиотика - лактоцида в количестве 100 мг на 1000 мл дис" тиллированной води (0,01). Приготовленный рабочий раствор содержит 40 0,1 мг лактоцида в 1 мл раствора.Е пробирку с 25 мп стерильной жидкой солодовой среды для опытных проб) наливают 3 мл 0,01-ного водного раствора лактоцида и 2,5 мл жид кой фазы посевной бактерии (общий объем 31,5 мл) - опытная проба.Контрольные пробы: одновременно в две пробирки с такой же питательной- средой наливают по 2,5 мл той же бактерии, что и в опытную пробу, и по 3 мл стерильной дистилпированной воды (вместо лактоцида) для того, чтобы общий объем был таким же, как в опытной пробе. Содержимое одной из контрольных пробирок (К 1 титруют сразу, а опытную пробу и контроль 11 ставят на 4 час в термостат и культивируют при 52 С, после чего охлажддают дробирки в пррточной воде и содержимое титруют. 40Для титрования из всех пробирок отбирают пробу 20 мл, добавляют 4 капли универсального индикатора марки "РСК" и тнтрование проводят 0,025 н раствором гидроксида (НаОН) 65Составитель Л, ПашининаТехред И.Асталош, Корректор И, Бабинац,Редактор А. Вер Заказ 7309/63 .Тирам 522 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретение и открытий 113035; Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП фПатент, 1. Ужгород, ул. Проектная, 4 титрование прироста молочной кислоты в контрольной (без лактоцида) и опытйой (с .лактоцидом) пробах, мл;а - количество лактоцида втитруемой пробе, г;2,766; 3,48 и 10 - постоянные расчетные коэффициенты,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Порошина Г.У. Выделение и свойства антибиотика, обладаюшего высокой антибиотической активностью в5 отношении молочнокислых бактерий.Микробиология, 1964, 26, вып. 6,с. 25-30.