Способ определения количества нитрифицирующих бактерий в исследуемом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1) ( 3)5 С 12 М 1/О ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЕСТИЙ В стных чо для ющей осится к биотехнолользовано для опредещей активности ила в кой очистки сточных Изобретение от гии и может быть ис ления нитрифициру процессе биологичзо ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬ(71) Харьковский отдел Всесоюзного комплексного научно-исследовательского и конструкторско-технологического институтаводоснабжения, канализации, гидротехнических сооружений и инженерной гидрогеологии "Водгео"(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИ ВА НИТРИФИЦИРУЮЩИХ БАКТЕР ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к технол скому контролю состояния ила в очи сооружениях и биологической очистке ных вод и может быть использован оперативной оценки его нитрифициру вод, Цель изобретения - упрощение и ускорение способа, Способ осуществляют следующим обра Тщательно перемешанную иловую сусию помещают в две пробирки, Первую трольную) пробирку помещают на ин в кипящую водяную баню. затем обе 2активности, т.е. способности ила окислять аммиак и азотистую кислоту, Цель изобретения - упрощение и ускорение способа. Тщательно перемешанную иловую суспензию помещают в пробирки, центрифугируют для отделения ила от надиловой жидкости, К полученному осадку добавляют смесь фосфатного буфера с гидроксиламином в соотношении 10:(1,0-1,2), рН смеси составляет 7,8 - 8,2. Затем приливают 1 мл хлористого трифенилтетразолия, концентрация которого составляет 9 - 110. Полученную суспензию инкубируют 10 - 60 мин при 30 С. Э кстракцию образовавшегося формазана осуществляют этанолом. После центрифугирования надосадочную жидкость колориметрируют и по калибровочной кривой определяют дегидрогеназную активность, выраженную в мкг восстановленного формазана. Количество нитрифицирующих бактерий определяют по формуле 19 С = = 19 А/0,34, где С - количество нитрифицирующих бактерий; А - дегидрогеназная активность, 4 табл. пробирки центрифугируют для отделения ( ) ила от надиловой жидкости. К полученному осадку добавляют смесь фосфатного буфера с гидроксиламином в соотношении 10:(1,0- 1.2). а затем приливают трифенилтетразо- а лий хлористый. Полученную суспензию инкубируют в течение 10 - 60 мин при т = 30"С, Экстракцию образовавшегося формазана осуществляют этанолом. После центрифугирования надосадочную жидкость колометрируют и по калибровочной кривой определяют дегидрогеназную активность, выраженную в мкг формазана, образуемого9 С = -- ,9 А 0.34 51015 20 25 30 35 40 50 55 1 г беззольного вещества биомассы в мин.Количество нитрифицирующих бактерий 1фазы определяют по формуле где С - количество нитрифицирующих бактерий, мл/кг беззольного вещества ила;А - дегидрогеназная активность, мкг формазана/г беззольного вещества, мин.П р и м е р 1. Иловую суспензию в количестве 5 мл (концентрация ила по бензольному веществу 0,16 - 1,5 г/л) помещали в часть пробирок и в течение 3 мин центрифугировали при 2 тыс. об./мин, Затем надсадочную жидкость сливали. К полученному осадку приливали 5,5 мл смеси М/15 фосфатного буфера с 5%-ным раствором гидроксиламина. Объемное соотношение фосфатного буфера к гидроксиламину составило: в первой пробирке; 10:0,4; во второй: 10;1,0; в третьей: 10:1,1; в четвертой: 10;1,2 и в пятой: 10:1,6, рН смеси доводили до,значения 8,0 раствором МаОН. К полученной в каждой иэ пяти пробирок суспензии приливали 1 мл 10-ного раствора трифенилтетразолия хлористого, перемешивали и помещали пробирки в водяную баню прис =30 С.Инкубацию вели в течение 35 мин, Пробирки центрифугировали, надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 5 мл этанола для экстракции образовавшегося формазана. Содержимое пробирок перемешивали, встряхивали, после этого пробирки вновь центрифугировали в течение 3 мин и надосадочную жидкость колориметрировали в кюветах толщиной 0,5 см с зеленым светофильтром,Затем по результатам определения относительной плотности ряда спиртовых растворов формаэана с концентрацией от 1 до 25 мкг/мл, строили калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс концентрации растворов формазана. а по оси ординат - значения экстинкций этих растворов, По калибровочной кривой определяли количество выделившегося формазана, Дегидрогеназную активность выражают в мкг восстановленного формазана, обазованного 1 г беззольного вещества ила в 1 мин.(см, табл.1),Результаты опыта представлены в табл,1,Как видно из табл.1, с увеличением количества гидроксиламина увеличивается количество выделившегося формазана. В четвертой и шестой пробирках при отношении фосфатного буфера к гидроксиламину,равном 10:1;0 и 10:1,6, соответственно, количество накапливаемого формазана практически не меняется, т.е. становится стабильным, Это свидетельствует о том, что в этом интервале взятого соотношения компонентов наступает зона устойчивой реакции. Поэтому дальнейшее увеличение количества гидроксиламина нецелесообразно. Таким образом, из приведенных данных видно, что соотношением, при котором достигается поставленная цель, является интервал 10;(1,0 - 1,2), Количество нитрифицирующих бактерий определяли по фор- муле о с Яд Я 4190 оо 10 0,34 0,34 Предлагаемая формула была проверена на большом числе объектов и показала вы-, сокую достоверность. Коэффициент корреляции составляет от 0,84 до 0,92 в зависимости от биоценоза. Н итрифицирующая способность активного ила является низкой при 9 С с 7, наблюдаемая при этом скорость окисления азота аммонийного с 2 мг/г беэз.ч; средняя при 7 19 С с 9 (скорость окисления азота аммонийного составляет 2 - 9 мг/безз.ч.); высокая при 9 С9 (скорость окисления азота аммонийного составляет9 мг/г безз.ч).П р и м е р 2, Определение значения рН смеси фосфатного буфера с гидроксиламином, при котором достигается максимальное выделение формазана, проводили в условиях, аналогичных примеру 1, Соотношение фосфатного буфера и гидроксиламина было оптимальным и составило 10;1,1,Результаты опыта приведены в табл.2.Как видно из табл.2, максимальное количество формазана выделилось при значениях рН смеси. равных 7,8 - 8,2,П р и м е р 3. Определение интервалаконцентраций раствора трифенилтетразолия хлористого, при котором достигается поставленная цель, проводили в условиях, аналогичных примеру 1. Соотношение фосфатного буфера и гидроксиламина составляло 10:1,1. рН смеси 8. Результаты опыта приведены в табл,3.Из табл.3 видно, что эффект достигается при значениях концентрации трифенилтетразолия хлористого в воде, равных 9 - 11%, т.е, в этом интервале находится эона устойчивой реакции. Дальнейшее увеличениеконцентрации трифенилтетразолия хлористого в воде нецелесообразно. Предлагаемый способ сравнивали спрототопим1730133 19 С =19 А/0,34,20 Таблица 1 аблица Таблица 3 Результаты сравнения представлены в табл.4,По данным таблицы можно заключить, что согласно предлагаемому способу значительно ускоряется и упрощается процесс определения количества нитрифицирующих бактерий в сравнении с прототипом,Формула изобретения Способ определения количества нитрифицирующих бактерий в исследуемом материале, предусматривающий помещение исследуемого материала в питательную среду и инкубацию до образования окрашенного продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, в качестве питательной среды используют фосфатный буфер, раствор трифенилтетразолия хлористого и гидроксиламина, при этом фосфатный буфер и гидроксиламин вводят одновременно при их соотношении б 10:(1,0 - 1,2) и рН 7,8-8,2 и концентрациираствора трифенилтетразолия хлористого 9 - 11 О/о с последующим определением по калибровочной кривой дегидрогеназной активности, а количество нитрифицирующих 10 бактерий определяют по формуле: где С - количество нитрифицирующих бак 15 терий, кл/г беззольного вещества;А - дегидрогеназная активность, мкг/гбеззольного вещества, мин.,5 10 20 25 Составитель Л,ЛукомскаяТехред М.Моргентал Корректор Н.Ревская Редактор С.Лисина Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 Заказ 1488Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5