Транс-2, 3, 11, 12-(4, 4-диамил)дибензо-18-корона-6 в качестве избирательного индуктора калиевой проницаемости биологических и искусственных мембран

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ о 1,763344 Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл.С 07 0 323/00 А 61 К 31/335 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Институт биохимии АН Узбекской ССР и Институтбиоорганической химии АН Узбекской ССР(54) ТРАНС,3,11,12-(4,4 -ДИАМИЛ) -ДИБЕНЗО-КОРОНА-б В КАЧЕСТВЕ ИЗБИРАТЕЛЬНОГОИНДУКТОРА КАЛИЕВОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИБИОЛОГИЧЕСКИХ И ИСКУССТВЕННЫХ МЕМБРАН Изобретение относится к новому химическому соединению - транс,3, 11,12-(4,4-диамил)-дибензо-корона-б, которое может найти применение в биологии и медицине в качестве избирательного иднуктора калиевой проницаемости мембран.Известны природные индукторы ионной проницаемости мембран, в частности антибиотики группы нактина, валиномицин, грамицидин 1.Однако природные ионофоры, несмотря на ряд преимуществ, химически малоустойчивы и труднодоступны, 15Известны также синтетические ионофоры - диацильные производные 2,3,11,12-18-короны-б, в частности транс,3,11,12-(4,4-дивалерил)-дибензо-корона-б 21 . 20Указанное соединение является преимущественно индуктором проницаемости биологических мембран по двух+ 1 Ф валентным катионам (Са , Мд- ), а кроме того, характеризуется низкой 25 избирательностью по отношению к иону калия, индуцирует транспорт ионов только через биологические мембраны, менее активен по действующей концентоации (в 100 раз) и плохо растворим в спирте, что ограничивает сферу его применения.Новое соединение - транс,3,11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-короны общей формулы 1,способное эффективнои избирательно увеличивать калиевуюпроницаемость как биологических,таки искусственных мембран подвергаютвосстановлению по Клемменсону.Структура полученного соединениядоказана данными ИК-, ЯМР и массспектроскопии.Синтезированное соединение Формулы. 1 способно давать комплексы с ионами щелочных металлов и избирательно индуцирует транспорт ионов калиякак через биологические, так и искусственные мембраны,П р и м е р 1, Синтез транс,3,11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-короны-б.Берут 1 г транс,3,11,12-(4,4дивалерил)дибензо-короны-б, 1,3 гамальгамированного цинка, 2,4 мл концентрированной соляной кислоты,0,5 мл воды и 50 мл этилового спирта, кипятят в течение 40 ч, добавляякаждый час по 0,2 мл концентрированной соляной кислоты, смесь декантируют с непрореагировавшего цинкаи отгоняют спирт, добавляя воду,Выделившееся масло экстрагируют хлороформом, промывают водой до нейтральной реакции, сушат СаС 6 и растворитель удаляют. 5Продукт реакции очищают колоночной хроматографией в системе гексанхлороФорм-ацетон - 3:2 г 0,5 и последовательной кристаллизацией иэ гексана и ацетона. Выход 0,5 г (53),т.пл.111-113 ОС.Найдено, Ъ С 72,18; Н 9,24,М.в.500,ЬО 14 ЬфВычислено,В С 71,97; Н 8,86; 11М.В. 500,6.ЯМР-спектр (м.д.)г 6,5-6,8 (6 Н,м,АгН); 3,8-4,2 (16 Н,мОСН ); 2,48(4 Н,Т,-СН); 1,00-1,70 (1 ВН,м,С-СН);0,82 (6 Н,Т, С-СНэ).ИК-спектр, см : 15 95,1520 (=СН);2950-2870, 1270-1150 (-С-О-С-); 870,810 (1,2,4 - замещенный бензол).П р и м е р 2. Специфику проницаемости, индуцируемой транс,3,11,12(4,4 -диамил) -дибензо-коронойна 25биологических и искусственных мембранных системах, исследуют на митохондриях и бислойных фосфолипидных мембранах (БФМ), которые являются классическими объектами для тестирования 30мембраноактивных свойств различныхсоединений.Митохондрии печени крыс выделяютметодом дифференциального центрифугирования, Проницаемость внутренних 35мембран этих субклеточных органеллопределяют по скорости снижения оптической плотности суспензии при 520 нмна фотометре ЛМФ, к выходу которого подключали самописец ОН. Измерения проводят при перемешивании встеклянных кюветах с длиной оптического пути 1 см. Инкубационные средыобъемом 3 мл содержат во всех случаяхингибиторы дыхания - ротенон и антимицин (по 0,33 мкг/мл) и 10 мм триснитрата (рН 7,45); кроме этИх компонентов среды содержат 130 мм нитратакалия или натрия, либо аммония (приизмерении проницаемости по Нф), или86 мм нитрата кальция, или магния или 50бария.Таким образом, энергозависимое на-. бухание митохондрий, обладающихсвойствами осмометров, лимйтируется только скоростью трансмембранного переноса исследуемого катиона, поскольку нитрат является анионом, проникающим через мембраны митохондрий. Использованные препараты этих органелл характеризуются .низкой проницаемостью по 60 всем катионам, исключая Са , который+транспортируется внуть митохондрий с высокой скоростью при помощи специфи ческого зндогенного кальциевого пеод носчика.Проницаемость для различных катионов оценивают по скорости набухания митохондрий, которую измеряют.в Ь Е /мин. В кювету со средой инкубации добавляют митохондрии (1,1-1,2 мг белка на 3 мл среды) и регистрируют скорость уменьшения оптической плотности в течение 1 мин. Затем в кювету вносят в зависимости от исследуемой концентрации 15-150 мкл спиртового раствора циклополиэфира и продолжают регистрацию еще 2-3 минуты. Контролем служат пробы, в которые вносят только соответствующий объем эталона.Результаты исследований показывают( табл.1) , что транс,3,11,12-(4,4 диамил)-дибенэо-коронав низких концентрациях (2,5 10 " -1 х 1 ОМ) индуцирует проницаемость митохондриальных мембран преимущественно для ионов К , в меньшей мере - для Н и Ма, не действуя даже при использовании существенно более высоких концентраций (5-10 ф 10 М) на скорость переноса цвухвалентных катионов. В присутст-б вии 1 х 10 М соединения 1 проницаемость митохондрий по йа увеличивается в 1,3 раза, по Н+- в 2 раза, в то время как по К+ - в 20 раз. Болеевысокие концентрации циклополиэфира (1"10- 1 ф 10 М) индуцируют общее увеличение проницаемости митохондрий для одновалентных катионов, однако проницаемость по К , по-прежнему, остается в несколько раэ выше, чем для Н и Маф . Так, относительная проницаемость митохондрий для калия, водорода и натрия индуцированная 110 М транс,3,11,12(4,4" -диамил) - дибензо-коронойсоставляет соответственно 1,0,46 и 0,075 (прирост проницаемости для калия принят эа 1). С увеличением концентрации соединения 1 в диапазоне 2,5"10 - 11 бМ калиевая проницаемость мембран митохондрий увеличивается линейно.Таблица 1Влияние различных концентраций транс,3,11,12-(4,4 -диамил) -дибензо-коронына проницаемость мембран митохондрий для некоторых одно- и двухвалентных катионов (А - проницаемость в присутствии циклополиэфира, Ьо - в контроле) 0,25 4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 7,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0,8 1,0 ,7 1,0 00,0 О,Эффекты, оказываемые синтезированым циклополиэфиром, на митохондрих, коррелируют с данными, получеными на бислойных фосфолипидных мембранах, БФИ из липидов белого вещества мозга быка формируют на отверстии диаметром 1 мм в тефлоновом стаканчике, помещенном в стеклянную кювету с буферным .раствором: 25 ммтрис-НС 6 рН 7,4). Мембранообразующий раствор содержит 20 мг фосфолипидов мозга в 1 мл декана. ПараметрыБФМ измеряют при помощи хлорсеребряных электродов, подключенных кэлектрометру ОР,Эксперименты, выполненные на БИФйпоказывают, что транс,3,11,12-(4,4 диамил)-дибензо-корона-б индуцирует проводимость бислоев, состоящуюиз калиевой и протонной компоненты.При использовании 5 х 10 М синтезированного циклополизфира проводимостьБФМ по Н увеличивается в 2,5 раза,а по К+ - в 7,5 раз, т.е. имеет местообщее снижение сопротивления в 10 разПри создании на мембране 10-кратногокалиевого градиента генерируетсямембранный потенциал, равный 58 мВ,т.е. циклополиэфир придает фосфолипидной мебране свойства калиевогоэлектрода, Вместе с тем, даже прииспользовании соединения 1 в концентрации 110 М не наблюдается индукциипроводимости бислоев для ионов кальция. Катионную специфичность предла-гаемого соединения.по ионам калияили натрия оценивают путем добавления с одной стороны БФМ 10 мМ Ка с другой - 10 мМ Ма, В присутствии 1 х 10, М транс,3,11,12-(4,4диамил)-дибензо-короны-б в этихусловиях на мембране генерируетсяразность потенциалов, равная 59 мв.Отсюда следует, что константа катионной специфичности К, йа равна 10.П р и м е р 3. Эффективную концентрацию транс,3,11,12-(4,4 н -диамил)-дибензо-короны-б, индуцирумазью калиевую проницаемость, опреде Таблица 2 концентраций-диамил)-дибен лиевую проницаеипосом и бислой- мбран Эф различных,11,12-(4,4сны-б на каохондрий, ллипидных ме транс,зо-ко мость ми ных фосф 35 4 9,0 28,0,7,0 Представлена проводимость БФМ вприсутствии 10 мМ КНа основании полученных результов транс,3,11,12-(4,4 ц -диамил)5 бензо-корона-б является избир ляют на биологических мембранах (митохондрии) и модельных системах(липосомы и БФМ). Проницаемость митохондрий и БФМ по Кф измеряют как ив примере 2. Липосомы готовят из 10спиртового раствора яичного лецитинапутем его диализа против водного раствора, содержащего 30 мМ КСВ и 30 мМтрис-хлорида (рН 7,4) с трехкратнойсменой буфера в течение 24 ч. Кинетику выхода ионов калия из липосомрегистрируют с помощью стеклянногоэлектрода ЭСЛГв комплексе слабораторным рН-метром рН, к выходу которого подключают самописецКСП. Шкалу регистратора калибруютраствором КС 6 известной концентрации.Данные, представленные в табл,2,показывают, что существует прямая пропорциональная зависимость между используемой концентрацией циклополи эфира и индуцируемой им калиевой про"ницаемостью на всех исследованныхобъектах. 5-10-кратное увеличениепроводимости по Кф достигают добавлением к мембранным структурам предлагаемого соединения в конечной концентрации 510 М, что в 100 раз меньшеконцентрации, в которой проявляютсямембраноактивные свойства его прототипа.763344 биологические и искусственные мембраны, а также для изготовления на его основе калий-чувствительных электродов для измерения активности ионов калия в жидких средах,5 формула изобретенияТранс,3,11,12-(4,4 -диамил)-ди 1 11ффянэо-уоронаформулы 1 Н в качестве избирательногокалиевой проницаемости бии искусственных мембран. 1. Ов об А. ы, М индукторалогических НОВ В.Т., ые комплеА аяв С 0 Источники инфОрмаинятые во внимание при и,кспертиэе Составитель И.Дьяченкоор Н.Горват Техред Н.Граб Корректор Г.Решетн е 495 венного к ретений и35, Раушс Подписноитета СССРткрытийя наб., д.4/5 аказ 6572/9 Тираж ВНИИПИ Госьдарс по делам иэоб 113035 Москва, 3.Ужгород, ул.Проектная тельным индуктором калиевой проницаемости всех типов мембран, в 100 разактивнее известных (2) по действующейконцентрации, хорошо растворим в спи .рте, в связи с чем более удобен дляисследования на биологических объек.тах и может быть использован в качестве инструмента при изучении механизмов транспорта ионов калия через Шк со по кл чинников Ю.А ИваМ. Мембраноактивн