Способ получения ферментных мембран

СОЮЗ СОВЕТСКИХаСЦИВЛНРМЕСНИКРЕСПУБЛИК 27/4 ЭЮ С 12 Н 11/08// ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕТЕЛЬСТВУ Н АВТОРСИО мкм. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДКФМ ИЗОБЩТКНИЙ И ОТНРЫТИ(7) Институт биохимии АН Литовской ССР(56) 1. Вгацп О., ТЬошав Р., ай.а 1. ЙеътшеЬо 4.,йох Ь 1 пйиц епгуше шо 1 есц" Гев Ы" йо а избег-хпво 1 цЬе шатхс; рторегйхез аНег 1 пзо 1 цЪИзаедоп " "В 3.осЬеш. Воеп 8", 7. 15, 1973, р. 359-375.2. Кулис Ю.Ю, Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов, Вильнюс, "Мокслас", 1981, с, 72.3. Акулова В.Ф., Вайткявичюс Р,К. и другие. Кинетика и стабильность глюкозооксидазы из Реп 1 с 111 ъцш 1 ч 1 йа 1 е. - Прикладная биохимия и микробиология, 1978, т. 14, вы. 3, с. 377,4, Ме 11.Ь.О., Ма 1 оу Л.Т. Ашрегошег 1 а гевропве епЬапсе - шеп ой СЬе йшпоЪ 111 гей е 1 цсове охЫаве епгуше, е 1 есйгойе.- "Апа 1.сЬеш.", 1976, ч, 48, В 11, 1597.(54) (57) 1., СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕН 1- НЫХ МЕМБРАН, включающий связывание ферментов с нерастворимым пленочным носителем в присутствии глутарового альдегида, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения ферментативной активности и механической прочности мембраны, процесс связывания ведут в присутствии сывороточного альбумина, а в качестве носителя используют макропористую лавсановую или поликарбонатную мембрану,2Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что используют макропористую мембрану с проницаемостью 4,7-11,47., диаметром пор 0,051-0,18 мкм и толщиной 9,5-1020 Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способамполучения ферментных мембран, которые могут найти применение в измерительных приборах на основе ферментов (ферментных анализаторах)дляопределения Физиологически важныхсоединений и ферментативной активности.Наиболее близким к изобретению 10является способ получения ферментныхмембран путем связьвания ферментов снерастворимыми пленочными носителями,(на основе целлюлозы, пирролидона ир др, полимеров)в присутствииглутарового альдегида И ,Однако полученные таким образомФермвнтные мембраны обладают низкоймеханической прочностью и малойактивностью. Это связано с тем,что целлюлозные, пирролидоновые идругие полимерные. носители не обладают макропорами, следовательно,непроницаемы для белковых молекул,которые лишь адсорбируются на поверхности пленки. Их количествомало, поэтому полученные мембраныне обладают высокой каталитическойактивностью. Кроме того, используемые пленочные материалы не обеспечивают механической прочности, поскольку они.набухают з воде.Целью изобретения является повышение ферментативной активности имеханической прочности ферментныхмембран.35Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу полученияферментных мембран, включающемусвязывание ферментов с нерастворимым плеиочным носителем в присутствии глутарового альдегида, процесссвязывания ведут в присутствии сьво.роточного альбумина, а в качественосителя используют макропористую45лавсановую или поликарбонатную мембрану;Причем используют макропористуюмембрану с проницаемостью 4,7-11,4 ,диаметром пор 0,051-0,18 мкм и тол-.щиной 9,5-10 мкм.50Повышение ферментативной активности и механической прочности, в первуюочередь, обусловлено применениеммакропористых пленочных носителей,обеспечивающих проницаемость мембран 55а также использованием сывороточногоальбумина, способствующего связыванию Фермента с носителем. Оптимальные параметры используемых мембран обеспечивают необходимый комплекс свойств получаемого в реэуль. тате изделия(см. табл. 1 и 2). Увеличение проницаемости(проницаемость мембран, выражена в процентах, показывает соотношение площади пор к общей площади мембраны и, следовательно, зависит от количества и диаметра пор)приводит к увеличению активности однако при этом падает механическая прочность. Таким образом, указанные параметры мембран являются оптимальными.П р и м е р 1. 600 ед. глюкозооксидазы растворяют в 0,6 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8, добавляют 0,4 мл 4,5 "ного сьвороточного аль 1 бумина и 0,04 мл 25 ."ного глутаровога альдегида. Смесь тщательно перемешивают и выливают на макропористую лавсановую или поликарбонатную мембрану 2020 смпроницаемость 9,5 , диаметр пор 0,12 мкм)и покрывают сверху гидратцеллюлоэной мембраной, толщиной 1 О мкм, Мембрану помещают в холодильник в течение 24 ч. Разре- зают на куски диаметром 2 см и накладывают на РФ электрод с И электродом контактирует гидратцеллюлозная мембрана)для определения Ферментативной активности. Толщина полученной мембраны 45 мкм.П р и м е р 2. Готовят смесь аналогично примеру 1 и наносят на лавсановую мембрану диаметром 6 мм, которая предварительно прикреплена к резиновому кольцу. Прикосновением микропипеткой наносятмкл смеси и накладьвают гидратцеллюлозную мембрану толщиной 10 мкм. Оставляют в течение 2 ч при комнатной температуре, наливают на Р 1 электрод и определяют ферментативную активность.П р и м е р 3. Мембрану готовят аналогично примеру 2, однако используют макропористую мембрану, толщина которой 9,5 мкм, проницаемость 114 и диаметр пор 0,13 мкм.П р и м е р 4. Мембрану готовят аналогично примеру 2, используя макропористую мембрану, толщина которой 10 мкм, проницаемость 4,7 и диаметр пор 0,051 мкм. П р и м е р 5, Мембрану готовятаналогично примеру 2, в качествеполупроницаемой мембраны применяютцеллофановую толщиной 55 мкм.1125249 15 50 где 1 П р и м е р 6. Мембрану готовятаналогично примеру 2, в качествеполупроницаемой мембраны используюттриацетатцеллюлозную мембрану,полученную путем выпивания 1 мл1,53-ного раствора триацетатцеллюлозы в стакан воды, диаметром 10 смтолщина мембраны 2 мкм.П р и м е р 7. Готовят смесь попримеру 1 и в количестве 1 мкл ее 111наносят на лавсановую макропористуюмембрану толщиной 10 мкм, проницае:мостью 9,57 и диаметром пор 0,12 мкм,которая прикреплена к резиновомукольцу, как в примере 2. Наносятацетатцеллюлозную мембрану толщиной10 мкм ацетатцеллюлозную мембрануготовят путем обработки 10 мкмтолщины гидратцеллюлозной мембраны(100 см)150 мл смеси абсолютногопиридина и уксусного ангидрида(1:1)при 50 фС в течение 13 ч. Толщинамембраны 25 мкм.П р и м е р 8. Аналогично примеру 2, но в качестве полупроницаемоймембраны используют полипропилентолщиной 10 мкм.П р и м е р 9,. Готовят смесь из:5 мг глюкозооксидазы и 15 мг пероксидазы по примеру 1. Ферментнуюмембрану готовят по примеру 2Ферментная активность глюкозооксидазной и глюкозооксидазной-пероксидазной мембран 1,глюкозооксидазная.активность определена на Р 1 электроде при 0,6 В(1-7)или -0,6 В(81 отн, 35Ад/А 8 С 1 электрода в 0,1 М фосфатномбуфере рН ,2; ферментативная активность глюкозооксидазной-пероксидазноймембраны определена в 0,1 М фосфатномбуфере рН 7,2 в присутствии 1 мМ 40ферроцианида калия на стеклоуглеродном электроде при О В отн.Ад/А 8 С 1электрода) приведена в табл. 1,Ферментативную активность биокаталитических мембран рассчитывают на фоснове величины тока ферментныхэлектродов по формуле, приведенной- плотность тока ферментного электрода; 11 - число переносимых электронов (2);Г - число Фарадея,- ферментативная активность,039ед/си ;3 - толщина ферментных мембран;Я - Концентрация субстрата,А - коэффициент, отражающийэлектрохимически активнуюплощадь электрода (0,01),4 .Полученные попредлагаемому способу мембраны в 10 раз прочнее механически, причем значительно выше ихферментативная активностьрасчитывается на основе величины тока фермент-ного электрода). Используются мембраны проницаемостью 4,7-11,43, диаметром пор 0,051-0,18 мкм. Увеличениепроницаемости приводит к увеличениюактивности(примеры 2-4) . Однако нетнеобходимости и даже нецелесообразно выходить за верхний предел проницаемости, так как примеры 4, 1,2, 9и 3 показывают, что с увеличениемпроницаемости(увеличением диаметрапор) уменьшается механическая проч-.ность(хотя и за пределами она былабы выше таковой . Наименьшей механической прочностью обладает мембранапо примеру 3. Таким образом, приведенные параметры являются оптимальными, обеспечивающими и достаточновысокую активность и высокую механи,ческую прочность. Сравнительные свойства глюкозооксидазной(1) и биферментной глюкозооксидазной-пероксидазной(2)мембран полученных по известному( целлюлозная мембрана толщиной 55 мкм)и по :предлагаемому способам (проницаемость ,макропористой мембраны 9,5 Х, диаметр .пор 0,12 мкм, толщина 10 мкм)приведены в табл. 2. Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в повышении ферментативной активности и механической прочности ферментных мембран, которые могут быть применены в ферментных анализаторах.:ф Уменьшение тока восстановления кислорода. Таблица 2 Мембра арактеристик Ток электрода, мкА/см 0,0045мМиО;0023 2 Ферментат активност наяед/см 0,2 2 Расхо ферментовмг/см 0 0,05 Время переходного состоянияс 10 0-30 Мембранаао примеРУ Толщинамембранымкм Параметры макропористой мембраны Ток злектррда, мкА/смдмМ 1,8052 Механическая прочность наа. разрыв, кг/мм1125 Ъ 9 Продолкение табл.2 Характеристика ернлизуетсяисью этилейй Стерилизуемость Прочностькг/мм 2 Составитель И.ПривалоТехред С.Легезактор Н,Джуга орректор А.Обручар Заказ 8435/8ВНИИПИ одпнсноСССР 1130 4/5 Филиал ППП "Патеитф, г, Уагород, ул. Проекатная, 4 Не стерилизуется(инактивация) . ыв,0,1-0,8 0,1-0,8 Тираа 52 Государственного к елам изобретений иМосква, Ж, Ра митетаоткрытийущская наб.,8,8 9,1