Способ модификации дезоксирибонуклеиновой кислоты

Союз Советсннх Соцналнстнчесмнх Республик(22) Заявлено 1712.76 (21) 2430224/23-04с присоединением заявки Ио(51)М. Кл. С 07 Н 21/04 РА 61 К 31/70 Государственный комитет СССР по дедам изобретений и открытий(53) УДК 547.963, ,32.07(088,8) Дата опубликования описания . 080580(7.1) Заявитель Научно-исследовательский институт медицинской радиологии АМН СССР(54) СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙКИСЛОТЫ В 2 - С 11 - ) П - С 110 К (1) Н 1 30 Изобретение относится к способаммодификации нуклеиновых кислот, вчастности к способу модификации,дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК),.который может найти применение приструктурном анализе нуклеиновых кислот и в медицине, в частности при изготовлении вакцин.Известны способы химической модификации ДНК, например,путем обработки ее раствором дифениламина в муравьиной кислоте, которые приводятк одновременному удалению пуриновыхоснований из молекулы ДНК 1) .Однако в литературе не описаныспособы, которые приводят к селективному отщеплению от ДНК аденина,что важно при структурном анализенуклеиновых кислот,Целью изобретения является получение препаратов ДНК с заданным содержанием в ней аденина.Цель достигается тем, что ДНКинкубируют с соединением обшей формулы где В 1 - СООН ОН. Нй - Н, СН (СН ), где и - 0-5, при рй - 4-6 и температуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции:(1) где т. - время от начала инкубации,мин;Х - количество отщепившегося аденина, В;К - константа скорости реакции,значение которой определяется монометилольным производным амина, используемого длядезаденимиэации ДНК, значением рН и температурой процесса.Предлагаемый способ модификации ДНК, который приводит к получению препаратов ДНК с заданным содержанием аденина в ней, заключается в том, что ДНК инкубируют с соединением формулы 1 при рН4-6 и темпеоратуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции.Реакцию модификации предпочтительно проводят следующим образом.732276 реакции формальдегида с амином рНреакционной смеси был равен 4-6,Иолярная концентрация амина в реакционной смеси превышает молярнуюконцентрацию формальдегида в 3 раза,что обеспечивает полное связываниеальдегида амином с образованием моном тилольного производного амина вконцентрации, равной исходной концентрации добавленного к растворуформальдегида.Для анализа препаратов ДНК, полученных при обработке монометилольнымипроизводными глицина,-аланинаили этаноламина, используют методионообменной хроматографии наДЭАЭ-целлюлозе в сочетании с хроматографией на бумаге.Термоденатурированную ДНК в концентрации 2,5 мг/мл инкубируют в течение 3 суток, 1,2,3,6 недель в0,1 М натрийфосфатном буфере с 0,4 Ммонометилольным производным глицина,-аланина или этаноламина при 30,36 или 50 С и при рН 4,0; 5,5 или6,0. Полученный препарат (1 мл) наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой( М 100 см) и элюируют 0,01 М натрийфосфатным буфером. В элюате присутствует только аденин. Кроме негоопределяемые количества других оснований не обнаруживаются. За появлением аденина следят спектрофотометрически,Спектрофотометрические характеристики вещества, снимаемого с ДЭАЭ-целлюлозой 0,1 М натрийфосфатным буфером (рН 6,8) при хроматографии ДНК,обработанной монометилольным производным глицина (ММГ), приведены втабл. 1,Таб лица 1 26 аЕадьо до до- после Е 25 бавле- добавния ления ЕММГ ММГ ЕМа Е а Едеа 26 а адьо ас,о Е 2 а 260 285 0,77 0,128 0,77 0,37 0,63 0,59 0,76 О, 25 0,76 0,37 0,57 0,60 Результаты, полученные в+ 1 Литературные данные для опыте.аденина в этих условиях,Связавшуюся с ДЭАЭ-целлюлозой ДНКснимают 1 М хлоридом натрия с 7 Ммочевиной, обессоливают и гидролизуют85-ной муравьиной кислотой (175 С,90 мин) . Гидролизат хроматографируют 60на бумаге в кислом растворителе Кирби(метанол: концентрированная НСС:НО - 7:2:1) и анализируют нуклеотиднйй состав гидролизата. Результатыприведены в табл. 2-6, 65 ДНК инкубируют с соединением формулы 1, которое является продуктом взаимодействия формальдегида и амина, предпочтительно с 0,4 И раствором монометилолглицина (В -СООН, В-Н), при рН = 4-6, предпочтительно 5,5, и температуре 30-50 С, предпочтительно 50 С.При значениях рН, меньших 4, резв ко возрастает скорость неспецифического отщепления от ДНК пуриновых оснований 1. При значениях рН, больших 6, скорость отщепления аденина от ДНК под действием монометилольных производных аминов значительно уменьшается.Увеличение температуры выше 50 С вызывает ускорение процесса неспецифического отщепления цитоэина, а уменьшение температуры инкубации ниже 30 С - замедление процесса отщеполения аденина от ДНК под действием монометилольных производных аминов,П р и м е р . Ниже приводятся условия, в которых происходит избирательное отщепление аденина от ДНК, вплоть до практически полного его удаления, под действием монометилольных производных глицина ( -аланина и этаноламина.Монометилольные производные амина получают при взаимодействии глицина, Р-аланина или этаноламина (х. ч.Веапа 1, Венгрия) с формальдегидом. Последний готовят из фармацевтического формалина (ИегК, ФРГ), Концентрацию формальдегида определяют йодометрическим методом, Все растворы готовят на 0,1 М натрийфосфатном буфере с таким рН, чтобы после добавления всех компонентов и завершения 5 1 О 15 20 25 30 35 Результаты по кинетике выщепления аденина из ДНК под действием монометилольных производных аминов поз - воляют рассчитать константу скорости этого процесса. Например, в условиях опыта, результаты которого приведены в табл, 6 (0,4 М монометилолглицин, рН 5,5, температура 36 С), К7,510 мин , Такая скорость в 1000 раз превышает скорость неспецифического732276 Т а б л и ок .14,4 34,4 25 р 2 5 26,2 8 1 н 0,2 28 П р и м е ч а К в 1,3,основанийбации ДНКом в 0,1 МирН 6,0табл. Процентно в молекуле Д с 0,4 М моно натрийфосфат и температур е содерж НК после метилолг ном буфе е 50 Сд ни ин иц е пно 2 5. абли б 5 суток 20 неделя 13 недели 2 суто не ечание:К 5 Прим ание:Кар ание основанийинкубапчи ДНК Р-аланином в м буфере при 30 С дано в ваний и ДНК 0,1 М содержание ос после инкуба тилолглицином м буфере при 36 С дано в Процентное в молекуле ДН с 0,4 М моном натрийфосфатн и температуре рН табл б л,8 31,6 22 36,49 55 14,5 34,3 . 24,4 10,5 ЗбрЗ 23,7 2 9 9,5 28,2 1,2 К: 7 римечан 4,15. меч Проц молек 0,4 М атрийф темпентное сле ДНКмономслсфатноматуре в с н 1, Способ уклеиновой ки 5 шийсятеотщепления аденина от ДНК в соответствующих опыту условиях, но в отсутствии ММГ.Данные о скорости процесса дезаденинизации ДНК под действием монометилольных производных аминов поз- воляют заранее рассчитывать время инкубации для получения препаратов ДНК с заданным соедржанием аденина в ней по Формуле (1) . Величины К для тех случаев обработки ДНК, которые приведены в примерах, представлены в табл, 2-6.Процентное содержание оснований в молекуле ДНК после инкубации ДНК с 0,4 М монометилолзтаноламином в 0,1 М натрийфосфатном буфере приорН 4,0 и температуре 36 С дано в 0,6 37,4 23 р 9 28,1 63 3,6 39,8 24 2 32,4 89 Процентное соде в молекуле ДНК пос с 0,4 М монометило 0,1 М натрийфосфат рН 4,0 и температу табл, 3держание оснований осле инкубации ДНК лолглицином в 0,1 М буфере при рН 5,5 С дано в табл. 40 31,5 24,5 24 О 29 , 5 34,2 26,4 25,9 53 р 9 41 рб 30,0 25,5 90 Формула изобретения дификации деэоксирибо оты,отличаю что, с целью получеТираж 495 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 1649/16 филиал ППП Патеит, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 ния препаратов дезоксирибонуклеиновой кислоты с заданным содержанием аденина в ней, дезоксирибонуклеиновую кислоту инкубируют с соединением общей формулык -сн-мн-сн он2 2 уВ 1где В 4 - СООН ОН. НВ - Н, СНэ(СН)п, где л = 0-5, при рй 4"6 и температуре 30-50 С в течение времени, которое определяют по константе скорости реакции100 ХФ 100где- время от начала инкубации,мин; Х - количество отщепившегося аденина, В;К - константа скорости реакции.2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве исходного реагента используют соединение формулы 1, где В - СООН, В - Н,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Кочетков Н.К., Будовский Э.И Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М Химия, 1970, с, 500-503 (прототип) .