Способ получения иммобилизованных вполиакриламидном геле ферментов

ОЛ ИСАНИЕИЗОБРЕТЕ Н ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз Советских Социалистических Республик. Кл.076 7/ явкис присоединением осударственный номитеСовета Министров СССРпо делам изобретенийн открытий 3) Приоритет3) Опубликовано 05,10.76.Бюллетень3 3) 77,15,0 (088,8) ования описания 15,02.(45) Дата опубл В. А. Кросинг, Э, Х, С А. И. Кест М. О. Ма Авторыизобретения итехническии институт лински) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ ФЕРМЕНТОВ я к технол Изобретение относиолучения иммобилизо рментов, в частности имприменения Выше опиммобилиз ля нек путем окис инициирован 20 чем отохи действиемщения, которое м ванне ферментов. атора фотополиме гостоящий катали мин В),ожет вызВ качест- ризации св вать инактиви ве одного ини тор-ри применяютбофлавин (в т обилизованных гидролаз, для в пищевой промышленности. Среди методов иммобилизации ферментов широкое применение находит включение их в полиакриламидный гель путем механического захвата или с дополнительным воздействием бифункциональных сшивающих реагентов. Иммобилизованные в полиакриламидном геле ферменты обладают хорошей химической стойкостью, приготовление их просто и дешево. Особенно целесообраз но получать и применять иммобилизованные ферменты в форме сферических микро- гранул. Для получения сферических микрэгранул иммобилизованных в полиакриламидном геле ферментов рекомендован метод полимеризации диспергированной в органическом растворителе полимеризационной смеси.Полимеризацию осуществляют химическим методом в присутствии окислительновосстановительных инициаторов длительным перемешиванием. Полученные гранули отличаются большой дисперсностью 11.Известен также способ получения связанных в полиакриламидном геле ферментов в форме сферических микрогранул требуемого размера, по которому водных растворов исходных веществ полимера и ферментов растворы диспергируют в специальной колонке Г 21. По такому способу полимеризационную смесь диспергируют в вазелиновое масло при помощи ибрирующего капилляра и полимеризацияпроисходит под действием освещения. санный способ применим дляации ряда ферментов. Однакоых ферментов полимеризациялительно-восстановительногоия является более эффективной,мическая полимеризация подОсуществление Окисилительыо-восстановительного иыицирсваыия при получении в полиакриламыднсм геле иммобилизоваыыых - фруктсфураыозидазы (иывертазы), бензилпенициллинамидсгидролазы (пенициллиыамидазы) и дру 1 их ферментов В присут" ствиии модификаторов приводит к значительному росту активности иммобилизованного фермента.Для получения иммсбилизоваыыых ферментов окислительыо-восстановительныминициированием аналогично приведенномупрототипу, где пслимеризация происходитпод действием Освещения, необходимо проводить смешивание одного из инициаторов(предпочтительно персульфата аммония) состальными компонентами непосредственноперед поступлением смеси в колонку,Предварительный контакт инициаторов пслимеризации с другими компонентами может вызвать преждевременную полимеризацию или инактивацию фермента.йелью изобретения является повышениеактивности иммобилизсваыыых ферментов.Поставленная цель достигается проведением процесса пслимеризации под действием окислительыо-восстановительных инициаторов, причем инициатор (предпсчтительнс персульфат аммония) досавляют к реакционной смеси в количестве 0,5 - 1,0 %и лучше ые раыьш , чем за 0,5 - 1,0 секперед дисперг ирсваыием ее в масло, например вазелиысвое,Необходимая бь:строта смешивания придиспергирсваыии достигается том, что реакционная среда вводится в масло черезвибриру 1 сщий капилляр, При этОм растворокислителя (персульфат аммония) направляют в колонку через внешнюю трубку, аостальные компоненты смеси (моысмерь,1фермент и Я Мтетраметилэтилендиамиы) - через центральнуюП р и м е р 1. Приготовляют 145 млраствора фермента в ацетатыом буфере,рН 4,5) с активностью 191 Е/мл, содержащего (в %); акриламида 12,6 Н, Я -метилеыбисакриламид 1,4 М,М, М, М -тетраметилэтилеыдиамиы 1,0, аыгидрид итакснсвой кислоты 0,2.Кроме того, готовят 145 мл 1,5%-ысгсраствора персульфата аммония в ацетатыомбуфере (рН 4,5).Пригстсылеыные растворы схлаждастодо +5 С и вводят через вибрирующий (частога вибрации 960 миы ) капилляр со скоростью 20 мл/миы в колонку с вазелиновыммаслом. Через 15 мин непрерывной работыотделяют готовую иммобилизованную инвертазу от масла центрифугированием на корзиночной центрифуге и промывают до исче,-ыовения следов масла. Получают 258,7 г геля с активностью в среднем 70,5 Е/гвлажного и с выходом 66% от исходной активности растворов,2,5 г этого материала помешают в реактор объемом 50 мл с 40 О/о-ным раствором рафинадной мелассы (отходный продуктДжамбульсксго сахарного комбината) . ГидроОлиз проводят при 50 С и рН 4,8 в течение 2 час степени превращения сахара до90%, Таким же способом проводят 50 пиклов гидролиза и собирают 2,5 л инвертного сиропа, который может быть использованв кондитерской промышленности в производстве помадных конфет.П р и м е р 2. Иммобилизованнуюв полиакриламидном геле инвертазу получают так же, как в примере 1, но растворинициатора (персульфат аммония) приготовляют в растворе фермента с активностью26191 Е/мл. Получают 263 г влажного геляс активностью в среднем 102 Е/г и с выходом 48, 3% от исходной активностирастворов,П р и м е р 3. Иммобилизованнуюв полиакриламидном геле инвертазу полуИчают так же, как в примере 2, но применяют ферментный раствор с активностью390 Е/г. Получают 247 г влажного геляс активностью в среднем 183 Е/г и с выходом 43,9% от исходной активности растЗО воров,Применение предлагаемого способа позволяет снизить себестоимость получаемыхиммобилизованных ферментов.Формула изобретения1. Способ получения иммобилизованныхв полиакриламидном геле ферментов в виде 4 сферических микрограыул посредством диспергироваыия в масло. подвергающейся полимеризации смеси через вибрирующий капилляр, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения активности иммобили 4 б зованыых фермЕнтов перед диспергированиекв масло к реакционной смеси добавляютокислительно-восстановительный инициаторполимеризации например персульфат аммония,в количестве 0,5 - 1,0 %.2.пособ по и. 1, отличаю.щ и й с я тем, что инициатор полимеризации добавляют к реакционной смеси не раньше, чем за 0,5 - 1,0 сек.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:Х. н. и А 55 оп,й.йоЬасЬ апй К.Мо 5 ЪасЕ,Всосал.ЫОРЬЦ 5 .Лсбх, 2 б 6,253,1972; 5. 6 е 51 ге Р(иа, В.МаИЕ- а 55 оа апс( к,мо 5 Ьасп, еиг. Б.Веасьесп., зб,69 Л 973.2. Авт. св. СССР414301, кл. С 13 фф 30,09.1971 (прототип) .