Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей

(5 Б Т А низ- сей ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ И СКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ(57) Использование: для определения комолекулярных гидрофобных приме Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в частности к получению химически модифицированных сорбентов для ВЭЖХ, и может быть использовано для определения низко- молекулярных гидрофобных примесей (например, лекарств) в биологических жидкостях,Известен способ получения сорбента, заключающийся в последовательной сорбции на поверхности упакованного в хроматографическую колонку силикагеля с привитыми октадецилдиметилхлорсилильными группами, бычьего сывороточного альбумина (БСА) и белков плазмы крови из фосфатного буферного раствора (рН = 7,4).Недостатком указанного способа является невысокая стабильность и однород 1 )ч 30/48, В 01 ) 20/10(например, лекарств) в биологических жидкостях, Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией включает последовательную обработку кремнезема с диаметром пор 6 - 10 нм кремнийорганическим модификатором и биологическими молекулами, в качестве биологических молекул применяют молекулы белков с молекулярной массой 40-90 тыс. дальтон, обработку проводят в буферном растворе вблизи изоэлектрической точки используемых белков, образующиеся глобулы которых имеют диаметр 9 - 15 нм, а для закрепления биологических молекул на поверхности используют глутаровый альдегид. 2 табл, 4 ил. ность слоя БСА, что приводит к изменению хроматографических свойств сорбента в процессе эксплуатации, особенно при использовании градиентного элюирования.Кроме того, в указанном способе затруднено получение сорбента с однородной по длине колонки поверхностью, особенно при использовании частиц силикагеля малого размера.Перечисленных недостатков лишен способ получения сорбента, заключающийся в последовательной обработке кремнезема с диаметром пор 6-10 нм. у-глицидоксипропилтриэтоксисиланом в водном буферном растворе, активирующим веществом (п-толуолсульфохлоридом), пептидом (используют глицил-лейцин) и ферментом (папаином), причем после обработки510 20 30 35 40 45 50 55 кремнезема у-глицидоксипропилтриэтоксисиланом, производится раскрытие эпоксидных групп в кислой среде (рН = 1,5) прикипячении в течение 1 ч. Однако указанныйсорбент весьма трудно получить с воспроизводимыми хроматографическими характеристиками (например, количествосорбируемого гемоглобина) из-за многостадийности модифицирования его поверхности, Кроме того, в слое модифицирующихвнутреннюю поверхность привитых групп,имеются вторичные аминогруппы, что обусловливает отличие такого модифицирующего слоя от модифицирующего слояООЯ-сорбентов, обычно применяемых дляанализа лекарственных препаратов и их метаболитов в очищенных от белков пробахбиологических жидкостей методом обращен но-фазной В ЭЖХ. Это приводит к изменению порядка выхода некоторыхлекарственных препаратов по сравнению спорядком выхода при использовании традиционных методик с ООЯ-сорбентами,Целью изобретения является упрощение получения сорбента и улучшение воспроизводимости его хроматографическихсВойстВ.Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения сорбента, заключающемся в последовательнойобработке кремнезема с диаметром пор 6-.10 нм алкилсиланом, раствором белка с молекулярной массой 40 - 90 тыс. дальтон иглутаровым альдегидом,В качестве белков с молекулярной массой 40 - 90 тыс, дальтон используют, например овальбумин, бычий или человеческий(ЧСА) сывороточный альбумин, что соответствует размеру белковых глобул 9 - 15 нм визоэлектрической точке данного белка,Использование белков с меньшими размерами и молекулярной массой, например,цитбхрома С, резко снижает коэффициентемкости, а использование белков с большеймолекулярной массой, например, фибриногена (330 тыс, дальтон), не позволяет проводить анализ лекарственных препаратов вплазме крови, поскольку некоторые из содержащихся в плазме белков имеют размеры меньшие, чем образующиеся врезультате обработки сорбента "окна" вовнешнем защитном гидрофильном слое избелковых глобул.Отличие предлагаемого способа состоит в том, что в качестве модификатора используется алкандиметилхлорсилан, вкачестве биологических молекул овальбумин, БСА или ЧСА, с последующим добавлением глутарового альдегида, причемобработка сорбента белком и глутаровым альдегидом проводится в буферном растворе вблизи изоэлектрической точки используемого белка,П р и м е р 1. 2,5 г силикагеля 9-300 (Лахема, ЧСФР) со средним диаметром пор 10 нм и частицами диаметром 15 мкм с гидроксилированной поверхностью помещают в абсолютный толуол, добавляют 0,4 мл морфолина и нагревают на песчаной бане до 140 С при медленном перемешивании механической мешалкой. В суспензию заливают 2 мл свежеперегнан ного октадецилдиметилхлорсилана и перемешивают смесь при той же температуре в течении 2 ч, Затем продукт последовательно отмывают на стеклянном фильтре абс. толуолом, продажным толуолом, ацетоном смесью ацетона и воды (60; 40), ацетоном и эфиром, а затем высушивают.Полученный сорбент промывают 0,1 М натрийфосфатным буферным раствором с рН = 5,15 и помещают в реакционный сосуд, снабженный мешалкой и нагревают на водяной бане до 40 С, 0,2 г человеческого сы 25. вороточного альбумина (ЧСА) (Реанал Венгрия) растворяют в 15 мл того же буферного раствора и заливают в реакционный сосуд с сорбентом. Полученную суспензию перемешивают при указанной температуре 3 ч.Полученный сорбент с адсорбированным ЧСА промывают на стеклянном фильтре 0,1 М натрийфосфатным буферным раствором (р Н = 5,15), суспендируют в 20 мл того же буферного раствора и добавляют 60 мл 5 О водного раствора глутарового альдегида. Суспензию перемешивают при 40 С 6 ч. Затем сорбент окончательно промывают на стеклянном фильтре сперва 0,1 М натрийфосфатным буферным раствором рН = 5,15, затем 0,05 М натрийфосфатным буферным раствором с рН = 7,0, и 40 О раствором изопропилового спирта в 0,05 М натрийфосфатном буферном растворе с рН,= 7,0.На фиг. 1 приведено хроматографическое разделение лекарственных препаратов в человеческой плазме при прямом вводе на колонку с Силасорбом Я(размер частиц 15 мкм), обработанным по предлагаемому спосооу, размер колонки 150 х 4 мм, На хроматограмме: 1 - белки человеческой плазмы, 2 - теофилин, 3 - кофеин. Подвижная фаза 0,02 М натрийфосфатный буферный раствор рН 6,50 - ацетонитрил (90: 10), расход 1 мл/мин, детектор - УФ (254 нм), объем образца 20 мкл.П р и м е р 2. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве исходного кремнезема используют силикагель КСК-Г с размером10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 частиц 10 мкм, а в качестве алкилсилана испол ьзуют гексадецилдиметилхло рсилан.На фиг. 2 приведено хроматографическое разделение лекарственных препаратов в человеческой плазме при прямом вводе на колонку с силикагелем КСК-Г, обработанным по предлагаемому способу, Размер колонки и условия хроматографического разделения такие же, как в примере 1, На хроматограмме: 1 - белки плазмы человеческой крови, 2 - ацетилсалициловая кислота, 3 - теофиллин, 4 - кофеин, Объем образца 20 мкл,П р и м е р 3. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве алкилсилана используют октилдиметилхлорсилан,На фиг, 3 представлено хроматографическое разделение лекарственных препаратов в человеческой плазме при прямом вводе пробы на колонку с сорбентом, полученным по предлагаемому способу. Условия хроматографического разделения, размер колонки и обозначения как в примере 2.П р и м е р 4, Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве исходного кремнезема используют силикагель Сс размером частиц 7,5 мкм, а в качестве белка - овальбумин.Хроматографические характеристики сорбента соответствуют хроматографическим характеристикам сорбента по примеру 2. П р и м е р 5. Синтез сорбента проводят так же, как в примере 1, Отличие состоит в том, что в качестве исходного кремнезема используют силикагель Силасорб 31-600 с размером частиц 10 мкм, а в качестве белка бычий сывороточный альбумин.Хроматографические характеристики сорбента соответствуют хроматографическим характеристикам сорбента по примеру 2.П р и м е р 6. (Прототип), 10 г силикагеля Силасорб Я(ЧССР) со средним диаметром пор 10 нм и частицами размером 15 мкм с гидроксилированной поверхностью помещают в 0,1 М натрий - ацетатный буферный раствор (рН 5,65) и нагревают на водяной бане до 95 С при медленном перемешивании механической мешалкой. Суспензию заливают 15 мл перегнанного у -глицидоксипропилтриэтоксисилана и перемешивают смесь при той же температуре 1 ч. Затем продукт отмывают на стеклянном фильтре водой и кипятят при перемешивании 1 ч в 0,01 М соляной кислоте для образования диольных групп вместо исходных эпоксидных, Полученный диольный сорбент промывают водой до нейтрального рН, промывают ацетоном, эфиром и 200 мл абсолютного диоксана, Помещают сорбент в реакционный сосуд, снабженный мешал-, кой.10 г предварительно очищенного и высушенного и-толуолсул ьфохлорида растворяют в 10 мл абсолютного диоксана и, добавив 15 мл абсолютного миридина, заливают в реакционный сосуд с промытым в диоксане сорбентом. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая, Полученную активированную гликофазу промывают на стеклянном фильтре 350 мл диоксана для удаления непрореагировавших остатков реакционной смеси, сушат и промывают карбонатным буферным раствором (0,15 М, рН 8,5),0,6 г глицинЧ-лейцина растворяют в 10 мл того же буферного раствора и добавляют туда же активированную гликофазу. Выдерживают при осторожном перемешивании и при комнатной температуре 2 ч, после чего модифицированный кремнезем отмывают на стеклянном фильтре от непрореагировавшего дипептида и обрабатывают 1 М трис-НС буферным раствором (рН 8,8) в течении 1 ч.0,5 гидрохлорида цистеина растворяют в 10 мл дистиллированной воды и доводят рН до 5,3 0,1 М КОН, Помещают в приготовленный раствор тщательно отмытый водой модифицированный кремнезем и снова доводят рН до 5,3. Прибавляют 5 мл раствора, содержащего 0,5 г папаина, и выдерживают при перемешивании 1,5 ч при комнатной температуре. Полученный таким образом сорбент промывают на стеклянном фильтре водой, 300 мл этанола и сушат.На фиг. 4 приведена хроматограмма разделения лекарственных препаратов в человеческой плазме при прямом вводе пробы на колонку с сорбентом, полученным д 3 и редлагаемому способу, Условия хроматографического разделения, размеры колонки и обозначения как в примере 1,В табл. 1 представлены сравнительные данные по хроматографическим характеристикам колонок с сорбентами, полученными по заявляемому способу и способу-прототипу. Хроматографические испытания проводили в условиях, описанных в примере 1, Наибольшие значения коэффициента емкости и селективности соответствуют сорбенту по примеру 1, наименьшие - прототипу (пример 6), Сорбенты по примерам 2-5 занимают промежуточное положение.В табл, 2 приведены данные о количестве сорбируемого из пробы белка для раз 1788463личных партий сорбентов, полученным пометодикам, описанным в примере 1 и примере 6 (прототипе).Из приведенных данных видно, что прототип позволяет получать работоспособный сорбент, но количества сорбируемого изпробы белка от партии к партии сильно меняется. Кроме того, как следует из результатов хроматографических исследованийприведенных на фиг. 4 при анализе лекарственных препаратов в человеческой плазме при прямом вводе пробы на колонку ссорбентом, полученным по способу - прототипу (пример 6), белки человеческой крови и ацетилсалициловая кислота выходят из колонки общим пиком 1 не до конца разделенным с пиками теофиллина и кофеина (2 и 3соответственно),Этих недостатков лишены сорбенты,синтезированные по примерам 1 - 5. Как видно из представленных хроматограмм и табл, 1, во всех случаях наблюдается полноеразделение компонентов пробы. Большеевремя удерживания ацетилсалициловой кислоты, теофиллина и кофеина позволяет при необходимости использовать более короткую хроматографическую колонку для выполнения анализа, чем при использовании сорбента, полученного по способу - прототипу. Данные о количестве сорбируемого из пробы белка для различных партий сорбентов, полученных по методике, описанной в примере 1, показывают хорошую воспроизводимость от партии к партии свойств доступной для белков пробы поверхности сорбента, Эти данные приведены в табл, 2,Как следует из результатов исследования, предложенный способ позволяет получать сорбенты, не уступающие по хроматографическим характеристикам прототипу и обладающие лучшей воспроизводимостью хроматографических свойств,Еще одним достоинством предлагаемого способа является более простое получение сорбента по сравнению с прототипом. После обработки кремнезема кремнийорганическим модификатором, в способе прототипе продукт отмывают на стеклянном фильтре водой и кипятят при перемешивании 1 ч в 0,01 М соляной кислоте для образования диольных групп вместо исходных эпоксидных. Полученный диольный сорбент отмывают водой до нейтрального рН, промывают ацетоном, эфиром и 200 мл абсолютного диоксана, В нашем способе эти операции исключены и сразу после обработки кремнезема кремнийорганическим модификатором, продукт отмывают на стекляйном фильтре,152025 30 35 40 45 50 55 Затем в способе-прототипе полученный сорбент помещают в реакционный сосуд, снабженный мешалкой, 10 г предварительно очищенного и-толуолсульфохлорида растворяют в 10 мл абсолютного диоксана и, добавив 15 мл абсолютного пиридина, заливают в реакционный сосуд с промытым в диоксане сорбентом. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая. Полученную активированную гликофазу промывают на стеклянном фильтре 350 мл диоксана для удаления непрореагировавших остатков реакционной смеси, сушат и промывают карбонатным буферным раствором.В предлагаемом нами способе, эти стадии исключены,Далее в способе - прототипе и в предлагаемом способе сорбент обрабатывают биологическими молекулами, отмывают на стеклянном фильтре и обрабатывают в способе - прототипе 1 М трис-НС буферным раствором, а в предлагаемом способе - водным раствором глутарового альдегида.После этого, в предлагаемом нами способе, сорбент промывают на стеклянном фильтре и сушат,В способе - прототипе 0,5 г гидрохлорида цистеина растворяют в 10 мл дистиллированной воды и доводят рН до 5,3. Прибавляют 5 мл раствора, содержащего 0,5 г папаина, и выдерживают при перемешивании 1,5 ч при комнатной температуре, Полученный таким образом сорбент промывают на стеклянном фильтре водой, 300 мл этанола и сушат.Как видно из приведенного сравнительного анализа, предлагаемый способ получения сорбента значительно проще способа, описанного в прототипе. Сокращение таких операций, как обработка соляной кислотой для образования диольных групп вместо эпоксидных, отказ от активирования сорбента и-толуолсульфохлоридом в абсолютном диоксане и обработка сорбента папаином в буферном растворе, не только упрощают способ, но и обеспечивают лучшую воспроизводимость хроматографических свойств сорбента от партии к партии. Мы связываем это с возможностью точнее контролировать ход синтеза и с отказом от наиболее трудновоспроизводимой стадии обработки поверхности модифицированного дипептидом сорбента ферментом (папаином). В предлагаемом нами способе после обработки кремнезема кремнийорганическим модификатором и отмывки полученного модифицированного кремнезема, производится сорбция биологических молекул (белков с молекулярной массой 40-9010 1788463 15 Таблица 1 аблица 2 тыс. дальтон) и закрепление их на поверхности обработкой глутаровым альдегидом,Таким образом, предлагаемый способ позволяет упростить получение сорбента, улучшить воспроизводимость его хроматографических свойств. Формула изобретения Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией, включающий последовательную обработку кремнезема с диаметром пор 6 - 10 нм кремнийорганическим модификатором и биологическим веществом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения воспроизводительности хроматографиче ских характеристик, в качестве кремнийорганического модификатора используют алкилсилан, в качестве биологического вещества белки с мол.м. 40 - 90 тыс. дальтон.при этом обработку ведут в буферном рас творе с рН вблизи изоэлектрической точкисоответствующего белка и сорбент дополнительно обрабатывают глутаровым альдегидом.Составитель А.СерданРедактор Техред М.Моргентал Корректо отыл Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 Заказ 71 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5