Способ получения -рибулозо-1, 5дифосфата

ОП ИСАНИЕ -667658ИЗОБРЕТЕН Ияк АВтОРскОму сВндетильстВУ Союз Соеетскик Соцмалнстнческнх Реслублнк(7) Заявител Институт кибернетики АН Зсгонской СС(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ц-РИБУЛ 030-1,5 СФА лучению орвных веществ ферментов. занимает зе органичес растениях ляясь акцеп Кальвина, Соизует ферксилаза (КФ естороннего ФасФариф- ииюа О а К,б-е- - О 6 Я- Рааозе- уасае- Ри 3 отлу-ф- Фидасуа;п Изобретение относится к и ганических биологически акти с помощью иммобилизованных ЭРибулозо,5-дифосфат центральное место в биосинге ких веществ во всех зеленых и в ряде микроорганизмов, яв тором углекислоты в цикле ответствующую реакцию катал мент рибулозо-дифосфат карбо 4.1.1.39), Предпосылкой вс изучения механизма действия Еб 9ЕС - ОК ,бак ЧроааафесФаф н 1 пиииюрююа ец Он 1 --ас - вк иС- ьк менга является наличие достаточного количества 2 рибулозо 1,5-,дифосфага.Получение 3 -рибулозо,5-дифосфага основывается на ферментагивном превращении 3 рибозо 5-фосфата в 3 рибуло зо,5-дифосфаг. Реакция прогекаег в две :гадии с участием ферментов рибозофосфагизомеразы (2 -рибозо-фосфаг-кетол-изомераза Кф 5.3,1,6) и фосфорибулокев назы (АТФ:й-рибулозо 5-фосфаг-фосфат грансфераза КФ 2,7.1.19) по следующейсхеме667558 3Известен способ получения 2 -рибуло=эо 1,5 дифосфата, имеющий промьнцленноезначение 1. По этому способу целевойпродукт получают ферментативно из 3 =-рибозо 5-фосфата и аденозин-трифосфага (АТФ) с применением в качествебиокатализагора бесклеточного экстрактатионовых бактерий ТИ 1 оЬооИов 5 ВЯ . По.лучение целевого продукта по этому способу предусматривае проведение трех основных стадий:получение ферментных препаратов рибозофосфатизомеразы и фосфорибулокиназы,синтез 3 -рибулозо,5-дифосфата ферментным путем из 3 -рибозо-фосфата 5и АТФ в атмосфере инертного газа, предпочтительно при рН 7,5-7,8;выделение препарата П рибулозо,5-дифосфата обычно в виде бариевой солии его очистка. 20Недостатком этого способа являетсяприменение в качестве ферментного катализатора водорастворимого бесклеточногоэкстракта тионовых бактерий. Водорастворимый бесклеточный экстракт тионовыхбактерий можно применять только однократно, В ходе выделения и очистки 3 -рибулозо,5-дифосфата из реакционной смесиферменты бесклегочного экстракта инактивируются необратимо, Б то же время выращивание бактерий и выделение бесклеточного экстракта являются наиболее трудоемкими этапами при получении 3 -рибуу.лозо,5-дифосфата.Целью изобретения является упрощениеспособа получения 2-рибулозо,5-дифосфата и повышение выхода целевого пропук таУказанная пель достигается тем, что4 Дбелки бесклеточного экстракта связываютна пористом стекле, активированном фосгеном и полученный иммобилизованныйферментный препарат используется многократно.Согласно изобретению описывается споЯ 5соб получения 2 -рибулозо,5 дифосфата путем взаимодействия 2 -рибозо 5фосфата и АТФ в атмосфере инертногсгаза с использованием в качестве биокаЯтализатора бесклеточного экстракта штамма ТМоЬосИиь 58 Р (Институт микробиологии АН СССР), иммобилизованногона пористом стекле, активированном фосгеном.55Процесс обычно проводят в атмосфереаргона дрп рН среды 8,4-8,6,Применяемый катализатор можно использовать многократно. Предпочтительно процесс проводят еле=.дующим образом,Исходное сырье." получают иммобилизованные экстракты тионовых бактерий посредством связывания их с пористым стек"лом, активированным при помощи последо-вательной обработки-аминопропилтри=этоксисиланом и фосгеном (изоцианатноестекло). Ьелки бесклегочного экстракта(10 мг/мл) связывают с акгивированнымизоцианатными группами стеклом (0,5 г/мл)в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,6-7,8)в течение 15-20 ч на холоду. Препаратотмывают от несвязанных белков 1 Мраст=вором ХаСсЦелевой продукт готовят следующимобразом.Готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты (указаны конечные концентрации), ммоль; МфСС 2 27;цистеин 6,63 2-рибозо 5-фосфат 27;АТФ 27. рН раствора доводят до 8,48,6 с помощью 2 н. ИаОН, Прибавляютк смеси иммобилизованный ферменгныйпрепарат (33 г на 1 л), Реакцию проводят в атмосфере аргона, отсутствие углекислого газа в системе является необходимым условием, при комнатной температуре, рН раствора поддерживают при 8,48,6 титрованием 2,0 н. раствором Ис 0 Н.Продолжительность реакции 2-3 ч. Жидкую фазу отделяют посредством декантирования, Стекло отмывают водой, Основной раствор и промывные воды объединяют, затем проводят частичную очистку целе=вого продукта и выделяют обычно в видебариевой соли известным методом.Технико-экономическая эффективностьот использования предлагаемого способадля получения В -рибулозо 1,5-дифосфата выражается в обеспечении по сравнейию с существующими способами следующих преимуществ; в связи с многократным применением биокагализатора умень=шаются расходы на выращивание микроорганизмов и выделение ферментного нрепарата, применение твердого биокатализатора позволяет увеличить выход 33 -рибулозо 1,5-дифосфата-в 1,8 раз по сравнению с растворимым ферментным чрепаратом,П р и м е р. Исходное сырье: 10 г пористого стекла обрабатывают в течение 30 ч 5 Ъным раствором-аминопропил триэтоксисилана в абсолютном толуоле (100 мл) при температуре кипения раст вора, После охлаждения стекло цромъща ют толуолом и обрабатывают в течение 2 ч 0,25 М раствором фосгена в абсолютеАнализ препарата на содержание шелочнолабильного фосфора показывает что пре парат содержит 75% Э -рибулоэо 1,5- -дифосфата,Проверку способности препарата акцеп тироватьуглекислоту проводят с 14 С ме ченным бикарбонатом натрия .в присутсх Вяи гомогената Высших растений. Резульд 5ном толуоле (20 мл) при температуре кипения толуола. В ходе обработки аминогруппы на поверхности стекла переходятв изоцианатные. Полученное изоцианатноестекло высушивают в вакууме при температуре ниже 100 С,оКлетки тионовых бактерий ТИ 1 ооосЕЕю 5582 (штамм выделен в Институте микро.биологии АН СССР) разрушают озвучиванием суспензии микробов в десятикратном 10количестве 0,1 М фосфатного буфера(рН 7,6) при 0 С в аппарате УЗУНУ4,2 при частоте 22 кГц в течение 10 мин,Оболочки клеток осаждают центрифугироваиием при 200006 в течение 40 мин.Связывание белков бесклеточного экотракта тионовых бактерий проводят в 0,1 Мфосфатном буфере (рН 7,6-7,8), 10 г активированного изоцианатными группамистекла суспендируют в 20 мл раствора,содержашего 10 мг белка в 1 мл.Полученную суспенэию вакуумируютдля удаления воздуха иэ пор стекла и оставляют в холодильнике (4 С) на 1520 ч при постоянном перемешивании,По 25лученный препарат промывают 1 л 1,0 Мраствора ИаСй в колонке в течениеЗчи хранят в холодильнике (4 фС)во,15 Мраствора МаСКПри составлении реакционной смеси30для преврашения 2-рибозо 5 юсфата ви -рибулозо 1,5-дифосфат эа основу былапринята методика, предложенная для определения рибулокинаэы: МСС 26 Н 0,переводят в натриевую соль. Для этого408 ммоль рибозофосфата бария (навеска 3,36 г. с учетом содержания в препарате 15% воды) растворяют в 40 мл охлажденной до 0 С 0,1 н. соляной кислоте и добавляют 8 ммоль (1,136 г безводной соли) сульфата натрия, Осадок Ва 045удаляют центрифугированием,Аденозин 5 -трифосфорная кислота, нат рриевая соль (АТф) 8 ммолъ навеску5,07 г растворяют в 30 мл воды50В четырехгорлую колбу емкостью500 мл снабженную механической мешалкой, электродами рН-стата и трубкамидля введения газа и титруюшего раствора,заливают 150 мл бидистиллированной во55ды, 20 мл раствора хлористого магния,10 мл раствора цистеина, 40 мл раствора рябово 5 фосфата натрия и Зомл раетвора АТф. Йобавлением 2,0 н. раствора 61 Га )П при интенсивном перемешиваниидоводят рН раствора до 8,4-8,6. Прибавляют 10 г ферментного препарата и водидо обшего объема 300 мл,Реакцию проводят в атмосфере аргонапри комнатной температуре, рН раствораподдерживают при 8,4 8,6 титрованием2,0 н. раствором Ч аОН, Продолжительность реакции 2-3 ч,Жидкую фазу реакционной смеси отделяют от стекла лекантированием, Стекло .промывают двумя порциями воды по 15 мл,Основной раствор и промывные воды объединяют и наносят на колонку (З,охЗОсм)с сильноосновным анионитом Эоюех-ВС 1-форме со скоростью 100 мл/ч. Лдсорбированные вешества элюируют линейньщградиентом соли и кислоты, составленнымиз 2,0 л бидисгиллированной водыи 2,0 лО,З М йаСЕ + О,ОЗ М НСЕ при скороо-,ти 100 мл/ч. Э -Рибулоэо,5-аифосфатвыходит из колонки сразу после АТФ,Разделение является неполным, фракции, содержащие 2 -рибулозо,5-дифосфат, объединяют, доводят рН раствора до 2,0прибавлением 2,0 н. раствора НСЕ. Прибавляют 15,0 г активированного медицинского угля, предварительно промытого вколонке 1 н. НС., а затем 10%-ной трихлоруксусной кислотой, и отмытого донейтральной реакции. Жидкую фазу отделяют от угля фильтрованием, уголь многократно (4 5 раз) промывают водой до20 мл, каждый раз суспендируя уголь вводе. Промывные воды объединяют с основным раствором и доводят до рН 6,0добавлением раствора М аОН,Затем к раствору добавляют 15 мл1,0 М раствора уксуснокислого бария ибариевую соль Э рибулозо,5-дифссфата осаждают добавлением 96% ного этанола до концентрации 30% (по объему).Осадок отделяют центрифугироваиием, промывают 80% ным этанолом и высущивают до постоянного веса в вакууме надР 05Вес полученного продукта (2,95 г)соответствует выходу 50% от теоретического.667558 Составитель Ь, бочаровРедактор Т. Йевятко Техред 3. Фанта Корректор М, ПожоЗаказ 3381/21 Тираж 512 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д, 4/5Филиал ЛПГ 1 "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 таты определения радиоактивности свидс-. тельствуют о высоком качестве полученного препарата как реактива-екцептора СОр ю5 Формула изобретения1. Способ получения П:рибулоэо,5= -дифосфата путем взаимодействия ,3 -рибозо 5-фосфата и аденозинтрифосфата в атмосфере инертного газа с использовани 10 ем биокатализатора, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процес са и повышения выхода целевого продукта,в качестве биокатализатора применяютбесклеточный экстракт штамма ТЬоЬсюйв58 В (Институт микробиологии ЛН СССР),иммобилиэованный на пористом стекле, активированном фосгеном,2, Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что процесс ведут прирН 8,4-8,6 в атмосфере аргона. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 3 Авторское свидетельство СССР